涎腺腺样囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC）作为一种涎腺罕见癌，神经浸润发生率、远处转移率以及局部复发率较高，患者预后较差，因其嗜神经性以及其高肺转移率越来越受到关注。SACC主要有三种组织学类:导管型、筛孔型以及实体型，其中实体型预后最差。　　近年来表观遗传学处于快速地发展中，基因启动子甲基化越来越受到重视，与微小RNA转录后调控不同的是，甲基化为转录水平调控，通过抑制甲基化基因mRNA的产生使蛋白生成减少。目前已在多种肿瘤中发现抑癌基因甲基化，而这也与肿瘤生成、进展及转移等密切相关。CDH1编码E-钙粘蛋白，后者介导细胞间粘附作用，为EMT相关的上皮标志物。在EMT过程中，包括E-钙粘蛋白在内的上皮标记物表达下调，间质标记物（如N-钙粘蛋白）表达上调。E-钙粘蛋白/CDH1基因失活的机制包括基因突变、异常蛋白加工以及启动子甲基化增加等。已在多种肿瘤中发现E-钙粘蛋白基因5端启动子区域CpG岛异常DNA甲基化，并且与E-钙粘蛋白表达降低有关，通过对一些肿瘤细胞株进行去甲基化药物(5Aza)的处理可以使E-钙粘蛋白重新活化，从而可以证明CDH1基因甲基化导致E-钙粘蛋白表达减少。　　越来越多的证据表明c-Myc和CCND1与CDH1以及EMT相关，本研究旨在探讨CDH1以及EMT在SACC中的作用以及CCND1和C-MYC的作用。我们选取浙江省肿瘤医院SACC手术标本以及2个SACC细胞株（SACC-LM和SACC-83）对CDH1甲基化水平、E-钙粘蛋白、CCND1和C-MYC的表达量进行检测。为了研究相关基因甲基化情况，我们对SACC细胞株（包括SACC-LM和SACC-83）进行了去甲基化处理(5-Aza-CdR)，并进一步研究CDH1在SACC中的作用。　　本研究分四部分进行:　　第一部分：涎腺腺样囊性癌中CDH1启动子异常甲基化研究　　目的:　　研究涎腺腺样囊性癌中CDH1基因启动子的甲基化状态并研究其临床意义。　　方法:　　采用甲基化特异性聚合酶链反应(qMSP)检测54例SACC和20例癌旁涎腺组织中CDH1基因启动子区域甲基化程度并分析其临床意义。　　结果:　　1.20例中癌旁涎腺组织中，0例(0％)检测到CDH1基因启动子5-CpG岛甲基化。54例SACC组织中，26例组织(48.2％)检测到CDH1基因启动子5-CpG岛甲基化，包括23例(42.6％)完全甲基化以及3例(5.6％)部分甲基化。比较SACC组织与癌旁组织CDH1基因启动子区5-CpG岛甲基化程度具有统计学意义(P＜0.05)，SACC组织CDH1启动子甲基化百分比显著高于癌旁组织。　　2.在所有SACC组织中，管型、筛孔型、实体型SACC中甲基化百分比分别为58.33％(7/12)、29.17％(7/24)、72.22％(13/18)，差异具有统计学意义(P=0.018)。　　3.SACC中，有淋巴结转移组CDH1甲基化百分比为100.00％(9/9)，显著高于无转移淋巴结组(40.00％，18/45)，两者之间存在统计学差异(P＜0.001)，　　4.SACC中，有远处转移组CDH1甲基化百分为100.00％(8/8)，显著高于无远处转移组(41.30％，19/46)，两者之间存在统计学差异(P＜0.001)　　5.所有SACC组织中，伴神经侵犯的CDH1甲基化百分比为73.33％(22/30)，明显高于无神经侵犯组(20.83％，5/24)，两者之间存在统计学差异(P＜0.001)　　6.T4期SACCCDH1甲基化为70.97％(22/31)，显著高于T1-3期SACC组(21.7％，5/31)，两者之间存在统计学差异(P＜0.001)　　7.在本次研究中，年龄、性别、肿瘤部位与CDH1甲基化无关　　结论:　　SACC中组织中发现CDH1基因启动子高水平甲基化，与肿瘤组织学类型、淋巴结转移、神经侵犯、远处转移以及T分期等相关，提示CDH1甲基化对SACC发生、发展及转移等具有一定意义。　　第二部分：CDH1蛋白以及mRNA在涎腺腺样囊性癌中的表达及其意义研究　　目的:　　检测涎腺腺样囊性癌中CDH1mRNA水平以及E-钙粘蛋白表达水平，并研究其临床意义，另外探讨E-钙粘蛋白水平与CDH1甲基化之间的相关性。　　方法:　　采用实时荧光定量PCR检测38例SACC癌组织以及其癌旁组织中CDH1mRNA水平，采用免疫组化法检测54例SACC和20例癌旁涎腺组织中E-钙粘蛋白表达水平，采用Spearman相关性分析研究E-钙粘蛋白与CDH1甲基化之间的相关性。　　结果:　　1.SACC癌组织CDH1mRNA水平显著低于癌旁组织，差异具有显著统计学意义(P＜0.001)。　　2.T1-3期SACC癌组织CDH1mRNA表达水平显著高于T4期SACC，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。　　3.在本次研究中，性别、年龄、淋巴结转移、远处转移、神经浸润以及骨组织浸润等无关(P＞0.05)。　　4.E-钙粘蛋白在癌旁涎腺组织中阳性率为100％(20/20)，主要定位于包膜及胞浆中，显著高于SACC癌组织中阳性率(55.6％，30/54)，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。　　5.在所有SACC组织中，实体型、筛孔型、管状型E-钙粘蛋白阳性率分别为33.33％(6/18)、75.00％(18/24)、50.00％(6/12)，三者E-钙粘蛋白阳性率之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。　　6.SACC中，有淋巴结转移组E-钙粘蛋白阳性率为0.00％(0/8)，显著低于无转移淋巴结组(66.67％，30/45)，两者之间存在统计学差异(P＜0.001)。　　7.有远处转移的SACCE-钙粘蛋白阳性率为0.00％(0/8)，显著低于无远处转移组(65.22％，30/46)，两者之间存在统计学差异(P＜0.05)。　　8.所有SACC组织中，伴神经侵犯的SACCE-钙粘蛋白阳性率为36.67％(11/30)，明显低于无神经侵犯组(79.17％，19/24)，两者之间存在统计学差异(P＜0.05)。　　9.T4期SACCE-钙粘蛋白阳性率为38.71％(12/31)，显著低于T1-3期SACC组(78.26％，18/23)，两者之间存在统计学差异(P＜0.05)。　　10.在本次研究中，年龄、性别、肿瘤部位与E-钙粘蛋白表达无关。　　11.相关性分析提示:E-钙粘蛋白表达与CDH1甲基化水平成负相关，E-钙粘蛋白表达随着CDH1甲基化增高而减少（r=-0.895，P＜0.001）。　　结论:　　CDH1mRNA和蛋白在SACC癌组织中表达较低，CDH1mRNA表达水平与肿瘤T分期相关，E-钙粘蛋白表达水平与组织学类型、淋巴结转移、远处转移、神经浸润以及T分期相关，相关性分析提示E-钙粘蛋白与CDH1甲基化水平负相关，CDH1对SACC发生、发展及转移等具有一定意义。　　第三部分：c-Myc和CCND1在涎腺腺样囊性癌中的表达及其意义研究　　目的:　　检测涎腺腺样囊性癌中c-Myc和CCND1的表达，并研究其与CDH1甲基化以及E-钙粘蛋白的相关性，探讨其临床意义。　　方法:　　采用免疫组化法检测54例SACC和20例癌旁涎腺组织中c-Myc和CCND1的表达水平，并分析其临床意义。采用Spearman等级相关法对c-Myc和CCND1与CDH1甲基化以及E-钙粘蛋白的相关性进行分析。　　结果:　　1.c-Myc在癌旁涎腺组织中均为阴性表达，在SACC癌组织中阳性表达率为79.6％(43/54)，差异有统计学意义（P＜0.001）。　　2.所有SACC组织中，伴有神经浸润组织中c-Myc阳性率为96.67％(29/30)，显著高于无神经浸润的组织(58.33％，10/24)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　3.所有SACC组织中，伴有远处转移组织中c-Myc阳性率为100.00％(8/8)，显著高于无远处转移的组织(76.09％，35/46)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　4.所有SACC组织中，伴有淋巴结转移的组织中c-Myc阳性率为100.00％(9/9)，显著高于淋巴结转移的组织(75.56％，34/45)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　5.在本次研究中，c-Myc表达与T分期、年龄、性别、肿瘤部位以及组织学类型等临床病理特征无关。　　6.CCND1在SACC癌组织中阳性表达率为88.9％(48/54)，而CCND1在癌旁涎腺组织中均为阴性表达，差异有统计学意义（P＜0.001）。　　7.所有SACC组织中，伴有神经浸润组织中CCND1阳性率为96.67％(29/30)，显著高于无神经浸润的组织(79.17％，19/24)，两者存在统计学差异(P＜0.05)。　　8.SACC癌组织中T4期组织CCND1阳性率为100％(31/31)，显著高于T1-3期组织(73.9％，17/23)，两者具有统计学差异(P＜0.05)。　　9.在本次研究中，CCND1表达与年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移、组织学类型以及远处转移等临床病理特征无关。　　10.Spearman等级相关分析显示:　　1)c-Myc蛋白表达与E-钙粘蛋白表达负相关（r=-0.869，P＜0.001），c-Myc蛋白表达随E-钙粘蛋白表达下降而升高。　　2)c-Myc蛋白表达与CDH1甲基化水平正相关(r=0.803，P＜0.001)，c-Myc蛋白表达随CDH1甲基化水平升高而升高。　　3)CCND1蛋白表达与E-钙粘蛋白表达负相关（r=-0.878，P＜0.001），CCND1蛋白表达随E-钙粘蛋白表达下降而升高。　　4)CCND1蛋白表达与CDH1甲基化水平正相关(r=0.846，P＜0.001)，CCND1蛋白表达随CDH1甲基化水平升高而升高。　　结论:　　c-Myc和CCND1在SACC癌组织中表达较高，c-Myc与肿瘤神经浸润、远处转移、淋巴结转移以及T分期相关，而CCND1与肿瘤T分期、神经浸润有关，Spearman等级相关分析说明c-Myc和CCND1均与E-钙粘蛋白表达负相关，与CDH1甲基化程度正相关。c-Myc和CCDN1影响SACC神经侵犯、肿瘤进展等。　　第四部分：SACC细胞株中CDH1异常甲基化启动EMT机制上调c-Myc和CCND1促进肿瘤转移　　目的:　　抑癌基因甲基化与恶性肿瘤相关，本部分实验主要研究涎腺腺样囊性癌(SACC)细胞株SACC-LM（具有高肺转移倾向）以及SACC-83（低肺转移倾向）用去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷(5-Aza)处理后细胞功能以及CDH1、EMT相关基因和c-Myc和CCND1表达量的变化;并将CDH1转染入SACC细胞株观察细胞功能变化以及c-Myc和CCND1表达量变化，从而探讨CDH1、EMT以及c-Myc和CCND1在SACC中的作用及机制。　　方法:　　分别采用MSP和RT-PCR检测5-Aza去甲基化前后CDH1甲基化程度和CDHmRNA表达水平;将CDH1转染到SACC-LM、83中使CDH1过表达，用RT-PCR和蛋白印迹验证其过表达，取生长良好的SACC-LM、SACC-83，采用MTS法观察转染后SACC-LM、SACC-83细胞活力改变，应用流式细胞仪检测细胞周期改变，利用细胞划痕愈合试验观察细胞迁移能力的改变，分析转染后EMT相关基因以及CCND1、c-MycmRNA和蛋白水平的变化。　　结果:　　1.SACC-LMCDH1甲基化程度高于SACC-83，但其CDH1mRNA表达水平低于SACC-83。5-Aza处理后，两株细胞CDH甲基化程度降低，CDH1mRNA表达水平升高。　　2.蛋白印迹及RT-PC产物琼脂糖凝胶电泳均表明转染成功。CDH1的过表达导致细胞活力减弱，集落生成减少，细胞爬行距离缩短，SACC-LM和SACC-83细胞G1期细胞比例降低，S期和G2/M期比例增高。　　3.CDH1过表达使c-Myc、CCND1以及EMT相关的基因(ZEB1、Vimentin、Snail、Twist)mRNA和蛋白均下降。　　结论:　　在SACC细胞株中，5-Aza去甲基化以及CDH1转染处理后均能恢复CDH1表达，并引起c-Myc、CCND1以及EMT相关基因的改变，抑制涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-LM、83迁移和侵袭能力。本部分研究证明在SACC-LM和SACC-83细胞中，CDH1启动子甲基化将启动EMT机制，并调节c-Myc和CCND1，促进SACC肿瘤转移。