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双酚A(bisphenolA,BPA)是一种典型环境内分泌干扰物,用于生产碳酸聚酯、环氧树脂、杀真菌剂、抗氧化剂、食品和饮料包装材料。由于BPA的化学结构类似己烯雌酚,与雌激素受体有一定亲和力,目前有关BPA对机体的毒性作用研究主要集中在BPA的弱雌激素效应上。近年BPA的神经毒性受到关注。本实验室前期研究发现,无论发育期还是成年期BPA暴露对雄鼠的学习记忆损伤更明显;促焦虑抑郁状态更显著。因此,推测BPA对雄性脑和行为的影响可能涉及对雄激素调节脑的干扰作用。突触可塑性主要涉及突触的发生、形态结构以及功能随刺激变化的能力,为脑认知功能所必需。成年雄性动物的前脑和海马神经元高表达雄激素受体(androgenreceptor,AR),雄激素主要参与调节雄鼠的突触可塑性和学习记忆,.而雌激素的作用相对较弱。雄激素缺乏不利于维持雄性海马的正常结构和功能活动,而正常雄激素水平有助于海马环路的稳定。因此,本研究通过离体培养的海马神经元,研究BPA对睾酮代谢产物无芳香化作用的二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)调节海马神经元树突密度和突触密度的影响,研究BPA干扰雄激素调节神经元树突和突触形态发育的作用。并用AR抑制剂(flutamide,Flu)与雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂(ICI 182,780)探讨BPA对神经元形态的调节是否经AR或ER介导;通过Western Blot技术检测海马神经元突触前标志性蛋白synapsinI、突触后标志性蛋白PSD-95及AR的蛋白表达水平,探讨BPA急性暴露对海马神经发育影响的分子机制;再用ERK1/2抑制剂(U0126)和p38MAPK抑制剂(SB203,580)预处理进一步分析BPA对树突棘与突触形成变化的信号途径。实验方法:分离新生24小时内的健康乳鼠脑内海马组织,离体培养12天后BPA(1、10、100 和 1000nM)、DHT(1、10、100nM)急性暴露 lh,用罗丹明标记的鬼笔环肽特异性标记海马神经元纤维型肌动蛋白F-actin,在激光扫描共聚焦显微镜下采集图像并用MetaMorph软件统计海马神经元30 μm二级树突上的树突棘密度,探究BPA、DHT暴露对神经元树突发育的剂量效应。用带有绿色荧光标记的二抗与synapsinⅠ(SynⅠ)一抗特异性结合,定位海马神经元突触前标志性蛋白SynⅠ,由SynⅠ(绿色荧光)和F-actin(红色荧光)共同定位突触(黄色荧光)的位置,分析海马神经元30 μm二级树突上的突触密度。用剂量效应明显的100 nMBPA与10 nM DHT或10 nM 17β-E2共处理进一步研究BPA对DHT、17β-E2调节树突棘与突触形成的干扰作用;然后,应用AR拮抗剂flutamide(Flu,1μM)、ER拮抗剂(ICI 182,780,10 μM)预处理探讨BPA是否通过AR或ER影响神经元的形态变化;最后应用ERK1/2抑制剂(U0126,25μM)或p38 MAPK抑制剂(SB 203,580,25 μM)预处理,分析BPA影响树突棘与突触形成的信号通路。同时,采用Western Blot技术检测海马神经元synapsinⅠ、PSD-95及AR的蛋白表达水平,进一步分析突触蛋白和雄激素受体变化在BPA急性暴露影响海马神经元树突和突触发育中的作用。实验结果:(1)BPA(1 nM-1 μM)急性暴露1 h,10 nM和100 nM BPA促进海马神经元树突棘密度和突触密度(P<0.001),而1000 nM的BPA处理时该促进作用消失,效应曲线为倒“U”型,提示BPA对树突形态的发育具有剂量依赖效应,即低剂量时促进,且100 nM时促进效果最佳,而高剂量1000 nM促进效应消失;(2)100nMBPA与10nMDHT共处理显著抑制10nMDHT对海马神经元树突棘密度和突触密度的促进作用(P<0.001),提示BPA具有拮抗雄激素的作用;但雄激素抑制剂flutamide预处理对100 nM BPA对海马神经元树突棘密度和突触密度的促进作用没有明显抑制作用,提示较低剂量BPA促进海马神经元树突棘和突触发生不是通过雄激素受体(AR)介导;(3)100 nM BPA与10 nM 17β-E2共处理显著抑制10 nM 17β-E2对海马神经元树突棘密度和突触密度的促进作用(P<0.001,P<0.05),提示BPA具有拮抗雌激素作用;同时,雌激素抑制剂ICI 182,780预处理完全抑制了 100nMBPA对海马神经元树突棘密度和突触密度的促进(P<0.01),提示较低剂量BPA促进海马神经元树突棘和突触发生是通过ER介导;(4)虽然U0126或SB 203,580单独处理时不影响海马神经元树突棘密度和突触密度,但ERK1/2抑制剂U0126或p38 MAPK抑制剂SB 203,580预处理均能显著抑制100 nMBPA对海马神经元树突棘密度(P<0.001)和突触密度(P<0.001)的促进作用,提示BPA对海马神经元发育的促进作用是通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路介导。(5)进一步Western Blot分析发现,BPA急性暴露1h显著上调突触前蛋白synapsinⅠ(P<0.01)和突触后蛋白PSD-95的表达水平(P<0.01),而BPA与DHT共处理显著下调synapsinⅠ(P<0.01)和PSD-95(P<0.01)的表达水平,提示BPA急性抑制DHT促进神经元树突棘与突触密度的作用与其改变突触相关蛋白Syn Ⅰ和PSD-95表达有关。结论:BPA剂量依赖性地影响海马神经元树突和突触形态发育,低剂量(10、100 nM)促进树突和突触形成;低剂量BPA(100 nM)的这种促进作用可通过ER而不是AR介导的MAPK/ERK 1/2和MAPK/p38信号通路进行。但在有雄激素或雌激素的环境下,BPA具有拮抗雄激素或雌激素促进树突棘和突触发育的作用。BPA干扰雄激素调节神经元树突棘发育和突触形成的作用与其改变突触相关蛋.白SynⅠ和PSD-95的表达有关。