10-23脱氧核酶沉默Survivin基因诱导HLECs凋亡的实验研究

来源 :泸州医学院 西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xuejun2004
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目的:设计针对Survivin mRNA序列的特异性10-23脱氧核酶(10-23DNAzyme),通过脂质体介导Survivin基因特异性10-23DNAzyme转染到人晶状体上皮细胞(HLECs)SRA01/04细胞珠,探讨沉默Survivin基因对Survivin mRNA表达及HLECs凋亡的影响,为后发性白内障的预防及治疗提供实验依据及新方法。方法:体外培养HLECs永生系SRA01/04,将细胞分为3组,空白对照组:HLECs+完全培养基;阴性对照组:HLECs+脂质体+非特异性10-23DNAzyme;实验组:HLECs+脂质体+特异性10-23DNAzyme。利用反义技术,以脂质体为载体分别将特异及非特异10-23DNAzyme转染至HLECs内,HLECs转染24h及48h后,采用倒置相差显微镜观察HLECs的生长状态及HLECs的形态改变。HLECs转染48h后,运用RT-PCR联合灰度扫描半定量方法检测HLECs中Survivin mRNA的表达情况,运用流式细胞仪(FCM)联合膜联蛋白V/PI(Annexin V/PI)双染法来检测HLECs的凋亡率。结果:运用倒置相差显微镜观察,转染24h后空白对照组、阴性对照组的HLECs细胞呈椭圆形或类圆形,均匀分散贴于培养瓶底,细胞的胞体无色透亮,胞浆丰富,细胞内含有粗细不一致的及排列紧凑的颗粒,少部分细胞胞体伸出凸起,与其它细胞凸起相连。48h后,细胞增多,细胞间隙减小,胞体伸出的凸起变少,呈类圆形。实验组的HLECs转染24h后,细胞开始变圆,染色质凝聚,胞质浓缩;转染48h后,部分细胞已经裂解成形态不一类圆形的凋亡小体,有的细胞已经脱离培养瓶底,漂浮在培养液中。转染48h后RT-PCR法联合灰度扫描半定量检测结果示:在空白对照组、阴性对照组及实验组中,HLECs的Survivin mRNA相对表达量分别为:0.726±0.148、0.700±0.115及0.314±0.130。实验组Survivin mRNA的相对含量分别和空白对照组及阴性对照组相比较,分别降低了56.75%和55.14%,差异具有明显统计学意义(P=0.000<0.05)。空白对照组及阴性对照组的Survivin mRNA的相对含量相比较无统计学差异(P=0.055>0.05)。流式细胞仪联合V/PI双染色法结果显示:HLECs转染48h后,空白对照组HLECs凋亡率为2.33±0.23%,阴性对照组HLECs凋亡率为3.57±0.20%,两组细胞之间HLECs凋亡率差异无统计学意义(P=0.072>0.05)。实验组HLECs凋亡率为19.52±1.16%,与空白及阴性对照组相比较,实验组HLECs的凋亡率明显增加,二者之间的差异具有统计学意义(P=0.000<0.05)。结论:特异性10-23DNAzyme可以有效沉默Survivin基因,抑制HLECs中surivivn mRNA的表达;HLECs中Survivin基因表达下调可促进HLECs凋亡。
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