研究背景和目的：　　肝癌是世界上排名第二位的肿瘤相关致死原因，在发展中国家表现尤为突出。近些年肝癌发病率在发达国家中越来越高，主要原因是丙肝病毒感染、酗酒、肥胖和代谢综合征相关的非酒精性脂肪肝等。因此，防治肝癌的进一步研究不仅在中国，而且在全球范围内都显得刻不容缓。　　目前肝癌的治疗手段主要包括手术切除、肝移植、肝动脉栓塞化疗和靶向治疗等。小分子多激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）是唯一一个适用于已丧失手术机会的晚期肝癌患者的全身靶向治疗药物。索拉非尼一方面可通过抑制Raf-1、B-Raf 和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中激酶的活性，从而抑制肿瘤细胞增殖；另一方面还可以通过靶向调控血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）受体、肝细胞因子受体c-Kit、Fms样酪氨酸激酶（Fms-like tyrosine kinase 3,FLT-3）、血小板衍生生长因子受体（Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-β）和其他酪氨酸激酶，达到抑制肿瘤血管生成的目的。但大部分晚期肝癌患者用药后短期内便会发生耐药，这严重限制了索拉非尼的临床疗效。虽然已有多项研究显示肝癌细胞索拉非尼耐药与PI3K/AKT信号通路、自噬、上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）、肿瘤微环境和表观遗传调控等有关，但仍然没有解决这一问题。因此，急需寻找更有效的关键机制来应对肝癌细胞索拉非尼耐药。　　程序性死亡配体1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）是40kDa I型穿膜蛋白，属于B7分子家族，与活化T细胞、B细胞、树突细胞和自然杀伤T细胞上表达的程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）结合，抑制免疫细胞活性，介导免疫耐受，从而促进肿瘤细胞生长。研究表明多种肿瘤高表达 PD-L1，通过自身PD-L1与肿瘤浸润免疫细胞上的PD-1结合，抑制免疫细胞的活化，从而实现肿瘤免疫逃逸。抗PD-L1单抗或抗PD-1单抗可以阻断PD-1/PD-L1的结合，解除对已活化免疫细胞的抑制作用，帮助免疫细胞恢复抗肿瘤功能，促进对肿瘤的杀伤与清除。抗PD-L1单抗或抗PD-1单抗在临床抗肿瘤过程中显示出令人瞩目的疗效。抗PD-L1单抗—阿特珠单抗（Atezolizumab）被FDA批准用于晚期非小细胞肺癌和晚期尿路上皮癌等实体肿瘤，而抗PD-1单抗—纳武单抗（Nivolumab）也被FDA批准用于索拉非尼耐药的晚期肝癌患者。PD-L1 介导的肿瘤免疫逃逸不仅促进包括肝癌在内的多种肿瘤的生长发展，而且还与肿瘤耐药密切相关。多项研究显示PD-L1在耐药肿瘤细胞中高表达，例如恩杂鲁胺耐药的前列腺癌、顺铂耐药的小细胞肺癌和厄洛替尼耐药的非小细胞肺癌，提示PD-L1可能参与多种肿瘤细胞的耐药机制。然而，目前尚不明确PD-L1是否参与肝癌细胞索拉非尼耐药。　　本文旨在探讨PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中的表达及功能。我们首先成功建立索拉非尼耐药人肝癌细胞株，并检测其PD-L1的表达。其次，在索拉非尼耐药人肝癌细胞中沉默PD-L1表达，观察其耐药性的变化。最后，在体内外通过siRNA沉默PD-L1的表达和采用抗PD-L1单抗—阿特珠单抗阻断PD-L1与PD-1的结合，进一步探究PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆集落形成、凋亡、裸鼠成瘤和裸鼠带瘤生存时间中的作用，为今后临床索拉非尼耐药情况下使用抗PD-L1单抗类靶向药物提供实验依据。　　研究方法：　　第一部分 索拉非尼耐药人肝癌细胞株的建立　　1.采用索拉非尼持续接触浓度递增法诱导人肝癌细胞株Hep3B和HepG2。选取对数生长期的肝癌细胞株Hep3B和HepG2，以各自的索拉非尼半数抑制浓度（half inhibition concentration, IC50）为起始诱导浓度，并以0.25μmol/L的浓度递增，历时6个月，获得索拉非尼耐药人肝癌细胞株Hep3B-SR和HepG2-SR。　　2.采用CCK-8法检测耐药细胞和亲本细胞的IC50。　　3.计算Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的耐药指数，耐药指数=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。　　4.qPCR检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中耐药基因（MDR1、MRP1）的表达。　　5.蛋白质印迹法检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中耐药蛋白（P-gp、MRP1）的表达。　　第二部分 PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中的表达　　1.qPCR在mRNA水平检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中PD-L1的表达。　　2.蛋白质印迹法在蛋白水平检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中PD-L1的表达。　　第三部分 在索拉非尼耐药人肝癌细胞中沉默PD-L1表达，检测其耐药性变化　　1.选取对数生长期的Hep3B-SR和HepG2-SR细胞进行PD-L1 siRNA转染，并转染Control siRNA作为对照，siRNA:20μmol/L。　　2.qPCR在mRNA水平检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中PD-L1沉默效率。　　3.蛋白质印迹法在蛋白水平检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中PD-L1沉默效率。　　4.成功沉默PD-L1表达后计算Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的耐药指数，方法参照第一部分。　　5.沉默PD-L1表达后qPCR检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中耐药基因（MDR1、MRP1）的表达变化。　　6.沉默PD-L1表达后蛋白质印迹法检测Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中耐药蛋白（P-gp、MRP1）的表达变化。　　第四部分 在索拉非尼耐药人肝癌细胞中沉默PD-L1表达或阻断PD-1/PD-L1结合，检测其增殖、迁移、侵袭、克隆集落形成和凋亡的变化　　1. 在人外周血中提取外周血单个核细胞并用抗CD3单抗和抗CD28单抗包被的磁珠活化，建立活化外周血单个核细胞与肝癌耐药细胞的共培养模型，然后在此模型的基础上进行细胞功能实验。Sorafenib:10μmol/L，siRNA:20μmol/L，Atezolizumab:10μg/mL。　　2.细胞增殖实验分组：PD-L1 siRNA组和Control siRNA组，Atezolizumab-NC组和Atezolizumab组。　　3.其余细胞功能实验分组：DMSO组、Sorafenib组、Control siRNA组、PD-L1 siRNA组、PD-L1 siRNA+Sorafenib组、Atezolizumab-NC组、Atezolizumab组和Atezolizumab+Sorafenib组。　　4.选取对数生长期的Hep3B-SR和HepG2-SR细胞进行PD-L1 siRNA转染，并转染Control siRNA做为对照。　　5. 在 Hep3B-SR 和 HepG2-SR 细胞中加入抗 PD-L1 单抗—阿特珠单抗阻断PD-1/PD-L1结合，并用PBS溶液做为对照。　　6.细胞增殖实验检测细胞增殖情况。　　7.划痕实验检测细胞迁移情况。　　8.Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。　　9.平板克隆形成实验检测细胞克隆集落形成情况。　　10.流式细胞术检测细胞凋亡情况。　　第五部分 体内沉默PD-L1表达或阻断PD-1/PD-L1结合，检测索拉非尼耐药人肝癌细胞的裸鼠成瘤能力和带瘤生存时间　　1. 购买4-5周龄健康SPF级雄性裸鼠，并在成都医学院中心实验室动物房适应环境1周。　　2. 在裸鼠右上肢下侧注射索拉非尼耐药人肝癌细胞1×107个/只。　　3. 采用胃管饲养法持续给予20mg·kg-1索拉非尼维持肝癌耐药细胞的耐药性，直到皮下成瘤体积增大至100mm3左右后停止。　　4.将裸鼠分为8组：Sorafenib-NC组、Sorafenib组、Control siRNA组、PD-L1 siRNA组、Atezolizumab-NC组、Atezolizumab组、PD-L1 siRNA+Sorafenib组和Atezolizumab+Sorafenib组。siRNA: 100 μg/只，Atezolizumab: 200 μg/只。　　5. 28天后处死，取瘤拍照并量体积。　　6. 生存分析：采用Log-Rank法检验生存曲线。　　结果：　　1. 成功建立索拉非尼耐药人肝癌细胞株　　计算耐药指数和检测耐药基因表达上调（P均＜0.01），证明索拉非尼耐药人肝癌细胞株建立成功。　　2. PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中表达上调（P均＜0.01）。　　3. 沉默PD-L1表达后部分逆转索拉非尼耐药人肝癌细胞的耐药性　　沉默PD-L1表达后索拉非尼耐药人肝癌细胞的耐药指数明显减小，耐药基因表达显著下调（P均＜0.01）。　　4. 沉默PD-L1表达或阻断PD-1/PD-L1结合抑制索拉非尼人耐药肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆集落形成和促进其凋亡（P＜0.01，P＜0.05）。　　5. 沉默PD-L1表达或阻断PD-1/PD-L1结合抑制索拉非尼耐药人肝癌细胞的裸鼠成瘤能力（P均＜0.01）。　　6. 沉默PD-L1表达或阻断PD-1/PD-L1结合延长索拉非尼耐药人肝癌细胞的裸鼠带瘤生存时间（P均＜0.01）。　　结论：　　PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中高表达，且促进人肝癌细胞对索拉非尼产生耐药性。PD-L1促进索拉非尼耐药人肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆集落形成、裸鼠成瘤和抑制其凋亡。联合使用索拉非尼与抗PD-L1单抗可增强二者的抗肿瘤效应。