目的:癫痫是一种发病机制十分复杂的疾病,尽管随着近年来抗癫痫药物的快速发展,仍有接近三分之一的患者会发展为药物难治性癫痫。在癫痫的发作间歇时期,病灶区域在18F-FDG-PET上经常表现为低代谢区域,而在发作期时则表现为明显的高代谢区域,这种现象目前为临床上指导癫痫定位诊断的一种重要方法。有趣的是,研究发现这种葡萄糖代谢的异常现象可能不仅仅是癫痫发作的一种表现,而且有可能是促进癫痫发生的一个重要的病理生理机制。生酮饮食是一种能量替代治疗方法,使患者的能量来源由葡萄糖转换为酮体,其在治疗药物难治性癫痫中获得了良好的结果。而且实验研究发现针对乳酸脱氢酶（LDH）的治疗也获得了抑制癫痫的作用,使得有关癫痫的葡萄糖代谢机制成为了研究的热点。非编码RNA在多种疾病中参与发挥了重要的功能,其在癫痫疾病中的作用近年来也被广泛研究。非编码RNA包括了长链非编码RNA（lnc RNA）、微小RNA（micro RNA）以及环状RNA（circRNA）等,其中circRNA近年来更引起了人们的关注,因为它们具有更稳定的结构,而且在脑组织中具有较高丰度的表达等特点。多项研究发现circRNA在癫痫中促进了神经元损伤及凋亡等。本次研究拟进一步探究circRNA在癫痫中参与调节神经元及星形胶质细胞葡萄糖代谢的相关机制。研究方法:1.在人类颞叶癫痫（TLE）患者病灶脑组织及正常对照脑组织中提取RNA进行q RT-PCR验证异常表达的circRNA;2.建立海人酸（KA）注射杏仁核模拟TLE的大鼠模型,在癫痫发作的不同时期（急性期、平台期及慢性期）取材后按不同区域（全海马、CA1区、CA3区及DG区）分别进行q RT-PCR、荧光原位杂交（FISH）及免疫荧光（IF）验证异常表达的circRNA;3.建立不同浓度KA诱导的SY5Y细胞模拟癫痫发作的神经元细胞模型,通过q RT-PCR实验验证异常表达的circRNA,并且进行MTT实验证明不同浓度KA对细胞活力的影响;4.对筛选出的circRNA进行Sanger测序、Rnase R、放线菌素D处理后的q RT-PCR及琼脂糖电泳实验,FISH实验以及核质分离PCR实验验证其环状结构及表达分布;5.在人类TLE患者病灶脑组织及正常对照脑组织中进行q RT-PCR及western blot实验验证PKM1、PKM2的表达;6.在TLE的大鼠模型中,在癫痫发作的不同时期（急性期、平台期及慢性期）进行小动物18F-FDG-PET-CT检查,观察大鼠脑组织的葡萄糖代谢变化;7.在TLE的大鼠模型中,在癫痫发作的不同时期（急性期、平台期及慢性期）取材后按不同区域（全海马、CA1区、CA3区及DG区）分别进行q RT-PCR、western blot实验验证PKM1、PKM2的表达水平,IF实验验证PKM2分别与Neu N、GFAP进行双染观察其表达分布特点;8.在SY5Y及NHA细胞中加入KA模拟癫痫细胞模型后进行ECAR、OCR、葡萄糖摄取率及乳酸产生率实验检测其对细胞葡萄糖代谢的影响;9.在SY5Y及NHA细胞中通过慢病毒转染进行过表达或沉默circSRRM4,进行q RT-PCR验证转染效率;10.在SY5Y及NHA细胞中过表达或沉默circSRRM4后进行q RT-PCR及western blot实验验证其对PKM1、PKM2的转录及表达的影响;11.在SY5Y及NHA细胞中过表达或沉默circSRRM4后进行ECAR、OCR、葡萄糖摄取率及乳酸产生率实验检测其对细胞葡萄糖代谢的影响;12.通过腺相关病毒（AAV）在大鼠海马组织中进行活体转染沉默circSRRM4,冰冻切片观察GFP荧光效率,提取RNA进行q RT-PCR实验验证转染效率及特异性;13.在AAV转染沉默circSRRM4后两周进行癫痫模型造模,然后在慢性发作期时观察癫痫发作频率、进行脑电图监测并且进行小动物18F-FDG-PET-CT检查,观察沉默circSRRM4后对癫痫发作的影响以及对脑组织葡萄糖代谢的影响;14.在AAV转染沉默circSRRM4后,大鼠模型在慢性发作期的活体实验完成后进行取材,进行q RT-PCR、western blot实验验证沉默circSRRM4在体内对PKM1、PKM2的转录及表达的影响;15.在AAV转染沉默circSRRM4后,大鼠模型在慢性发作期的活体实验完成后进行取材,通过IF双染PKM2与GFAP,观察沉默circSRRM4对PKM2及对活化的星形胶质细胞的影响,通过尼氏染色观察对神经元丢失的影响;16.在稳定转染并过表达circSRRM4的细胞裂解物中加入生物素标记的circSRRM4的探针进行pulldown实验,将下拉后的样品进行SDS/PAGE后进行银离子染色,分析差异条带,把条带切下进行液相色谱法质谱分析（LC-MS）鉴定结合蛋白;17.通过在人类TLE患者病灶脑组织及正常对照脑组织中进行q RT-PCR及western blot实验验证SRSF3的转录及表达;18.在SY5Y及NHA细胞中过表达或沉默circSRRM4后进行q RT-PCR及western blot实验验证其对SRSF3转录及表达的影响;19.通过RNA免疫共沉淀（RIP）及pulldown实验验证circSRRM4与SRSF3的结合;通过FISH及IF双染在SY5Y及NHA细胞中验证circSRRM4与SRSF3的结合作用;20.在过表达或沉默circSRRM4的细胞中,加入CHX或MG132处理后进行western blot实验观察circSRRM4对SRSF3的转录后表达的调节作用,并通过SRSF3抗体进行免疫共沉淀（IP）,使用泛素抗体进行免疫印迹验证circSRRM4对SRSF3的泛素化水平的影响。21.通过在过表达circSRRM4的细胞中沉默SRSF3,然后进行q RT-PCR、western blot、OCR、ECAR、葡萄糖摄取率以及乳酸产生率验证circSRRM4是通过SRSF3调节PKM的选择性剪切过程进而影响疾病表型的。结果:1.CircSRRM4在TLE患者脑组织中的表达显著升高;2.在癫痫大鼠模型中发现,与对照组相比circSRRM4在急性期表达明显升高,在平台期回归至正常,在慢性期表达再次升高;circSRRM4在癫痫组的CA3区及DG区中表达明显升高,而CA1区表达无明显差异;3.在SY5Y细胞中加入200-250μM的KA药物后可以使circSRRM4表达明显升高;4.CircSRRM4可以以稳定的环状结构存在,并且主要分布在细胞质中;5.癫痫大鼠模型的海马组织表现出葡萄糖代谢异常:KA注射侧的海马病灶组织的葡萄糖摄取率在急性发作期明显升高,至平台期出现降低,在慢性发作期降低最明显;6.CircSRRM4在癫痫慢性期在活化的星形胶质细胞中表达升高:通过FISH及IF双染实验发现circSRRM4在对照组中主要表达于海马椎形细胞的细胞质中并呈较弱的荧光强度,在急性期组circSRRM4的荧光强度明显增强,而至平台期时荧光强度回归至较低水平,最后在慢性期组发现在CA3区circSRRM4的荧光强度明显升高且与同时明显增高的GFAP的共定位指数明显增多;7.在TLE患者中的PKM1的转录与表达显著降低而PKM2的转录与表达显著升高;8.PKM2的转录水平在癫痫大鼠的癫痫急性期显著升高,至平台期稍有下降,进入慢性期以后PKM2的转录水平再次显著升高。而PKM1的转录水平在癫痫急性期明显升高,至平台期下降到正常水平,而到慢性期时PKM1的转录显著下降;9.在癫痫急性期时PKM2在海马锥形细胞中的表达显著升高,至平台期后降低至正常水平,至慢性期以后PKM2再次升高。GFAP在进入到平台期时开始出现升高,至慢性期以后显著升高。通过共定位分析发现,PKM2与GFAP在进入到平台期至慢性期以后共定位指数开始显著升高。10.沉默circSRRM4后可以降低了癫痫大鼠的发作频率、改善了海马局部葡萄糖低代谢及海马神经元丢失,并且降低了PKM2的转录表达以及缓解了星形胶质细胞的活化;11.CircSRRM4可以在SY5Y及NHA细胞中促进PKM2的转录及表达并且抑制PKM1的转录及表达;CircSRRM4可以在SY5Y及NHA细胞中促进糖酵解能力、促进葡萄糖摄取及乳酸产生率并且降低有氧磷酸化能力;12.CircSRRM4可以与SRSF3相结合,并且通过抑制SRSF3进入泛素蛋白酶体系统而降解从而使SRSF3的表达升高;13.CircSRRM4使通过SRSF3调节PKM的选择性剪切过程,促进PKM2的转录进而影响疾病表型的。结论:1.CircSRRM4可以通过降低SRSF3泛素化水平,使其稳定性升高,从而调节了PKM的选择性剪切过程,提高了PKM2的表达,提高细胞的糖酵解水平,为癫痫的发病提供能量基础;2.沉默circSRRM4后可以减少癫痫的发病率及发作频率,改善海马局部低代谢情况,并起到了保护神经元丢失及缓解胶质细胞活化的能力。