论文部分内容阅读
TRPV3（Transient Receptor Potential Vanilloid subtype 3）通道是非选择性阳离子通道TRP通道超家族香草酸型亚家族的一个成员,参与很多生理过程。TRPV3在多种组织均有表达,在维持皮肤屏障、介导瘙痒,促进创面愈合、促进毛发生长等方面起重要作用,也与摄食,焦虑等行为有关。研究表明,TRPV家族在听力的形成与维持方面具有重要的作用。TRPV1-V4均在内耳Corti器官的毛细胞中表达,TRPV1和TRPV2表达上调或TRPV4表达下调均可致听力受损,TRPV1对氨基糖苷类抗生素所致药物性耳聋敏感。TRPV3与TRPV1或TRPV4在耳蜗中存在共表达,其是否具有和TRPV1,TRPV4相似的作用呢?其在听觉中的作用尚不清楚。TRPV3在血管组织丰富表达。在皮肤,激动TRPV3通过NOS非依赖途径释放NO而使皮肤血管舒张。在脑动脉中,激动内皮细胞中的TRPV3后,能够通过Ca2+激活IKCa、SKCa使平滑肌细胞超极化而舒张血管。而在大鼠桡动脉,内皮依赖性NO-GC-PKG通路与平滑肌Ca2+激活的IKCa通道均参与了TRPV3舒张血管过程。综上,TRPV3在血管组织的表达与分布、对血管舒缩的作用以及对血压的影响均未得以阐明。本课题分为两个部分:一、TRPV3在听力中的作用及机制;二、TRPV3在血压调节中的作用及机制。第一部分:TRPV3在听力中的作用目的:探究TRPV3通道在内耳中的表达与分布及其在听力中作用。方法:1.TRPV3野生型（TRPV3 wild type,V3WT）与TRPV3敲除（TRPV3 knockout,V3KO）小鼠用于本实验。2. 免疫荧光染色实验:MyosinⅦA特异性标记毛细胞胞体,Phalloidin特异性标记毛细胞纤毛;（1）通过激光扫描共聚焦显微镜成像探究TRPV3在内耳中的表达与分布;（2）在V3WT与V3KO小鼠的内耳毛细胞检测TRPV1、V3、V4亚型的表达差异、毛细胞及纤毛表型差异。3.听力检测:检测V3WT与V3KO的小鼠的听觉脑干反应（ABR）与畸变产物耳声发射的测量（DPOAE）,检查小鼠听力、辨析小鼠听力差异。4.给予小鼠卡那霉素,诱导听力损伤模型:（1）比较V3WT与V3KO在诱导药物性耳聋中的表现;（2）TRPV各亚型的表达差异及毛细胞表型差异。结果:1.免疫荧光染色结果显示,TRPV3在内耳的毛细胞中丰富表达,在血管纹与螺旋神经元中未检测到。在毛细胞中,TRPV3主要表达于毛细胞胞体,外毛细胞（Outer hair cell,OHC）明显高于内毛细胞（Inner hair cell,IHC）,而TRPV3在静纤毛中几乎没有表达。2. 对V3WT与V3KO的小鼠进行DNA鉴定后,耳蜗组织荧光染色表明,V3KO小鼠的毛细胞中未见TRPV3荧光,确证V3KO小鼠的TRPV3的基因已敲除。3.测定V3WT与V3KO小鼠的ABR与DPOAE的阈值,结果表明,72%的V3KO小鼠听力正常,28%的V3KO小鼠听力受损,后者显著高于V3WT小鼠（94%听力正常、6%听力受损）。荧光染色实验结果显示,听力正常的V3KO小鼠的毛细胞与纤毛的形态和数量未见明显变化,而听力受损的V3KO小鼠则受损严重。与之对应,TRPV4在听力正常的V3KO小鼠毛细胞中的表达显著上调,而在听力受损V3KO小鼠的表达则明显下调。TRPV1在听力正常与受损的V3KO小鼠中未见明显差异。4.连续皮内注射卡那霉素（1000 mg/kg）14天、间隔14天诱导动物药物性耳聋。结果显示,给药后V3WT小鼠的ABR阈值显著升高,而V3KO小鼠的听力阈值无明显变化。免疫荧光染色结果显示,V3KO小鼠毛细胞中的TRPV4的表达明显高于V3WT小鼠。小结:1.TRPV3主要表达在内耳毛细胞的胞体,在纤毛几乎没有表达,且外毛细胞的表达明显高于内毛细胞。2. TRPV3基因敲除后,约70%的小鼠听力正常,约30%的小鼠听力受损,这个比例显著高于V3WT小鼠。听力正常的V3KO小鼠其毛细胞TRPV1的表达不变,而TRPV4的表达显著升高,毛细胞形态和数量未见异常。听力受损的V3KO小鼠毛细胞,TRPV4表达显著下调,毛细胞形态和数量显著受损。这说明,TRPV3敲除后TRPV4在毛细胞的补偿性表达升高能够维持小鼠的正常毛细胞数量和形态,维持正常听力;而TRPV4表达下调则导致毛细胞受损、听力丧失。3.给予卡那霉素后,V3WT小鼠的听力受损严重,而V3KO小鼠的听力维持正常。后者内耳毛细胞TRPV4的表达明显升高,毛细胞形态和数量未见异常。第二部分:TRPV3在血压调节中的作用及机制目的:探究TRPV3在血压调节中的作用及其机制方法:1.TRPV3野生型（TRPV3 wild type,V3WT）与TRPV3敲除（TRPV3 knockout,V3KO）小鼠用于本实验。2.采用无创鼠尾血压测定法与颈总动脉插管法测定小鼠血压,前者用于筛选、后者用于测定。（1）观察TRPV3敲除后血压的变化。（2）插管法测定血压时,同时股静脉给药,观察TRPV3激动剂与抑制剂对血压的影响。3. 采用ELISA试剂盒,测定小鼠血液中的去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）水平。4. 取小鼠的胸主动脉、腹主动脉与肠系膜动脉（分别代表大、中、小动脉）行免疫荧光染色实验,观察TRPV3在血管中的表达与分布。5. 微血管张力测定仪测定V3WT与V3KO小鼠主动脉血管张力,分别给予去氧肾上腺素（Phenylephrine,Phe）与乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）测定血管的收缩与舒张能力,并比较两者是否有差异。6. 用荧光探针DAF-FM DA标记NO,激光扫描共聚焦显微镜观察测量TRPV3敲除后NO含量的变化。7. 连续三周灌胃给予一氧化氮合酶抑制剂L-NNA（700 mg/kg）抑制NO的生成,建立高血压动物模型,利用Western blot技术探究TRPV3的表达变化,进一步探讨TRPV3在血压调节过程中的作用。结果:1.与V3WT小鼠相比,V3KO小鼠的收缩压与舒张压均显著升高。股静脉给予TRPV3特异性激动剂香芹酚,V3WT小鼠动脉血压明显下降,而V3KO小鼠的动脉血压无变化。给予TRPV通道抑制剂钌红后,V3WT血压升高。ELISA测定NE,V3KO小鼠血液中的NE水平明显高于V3WT小鼠。2.荧光染色结果显示,在胸主动脉、腹主动脉与肠系膜动脉均有TRPV3表达,包括平滑肌与内皮细胞。3.在PHE诱导血管收缩与ACh诱导血管舒张的过程中,V3WT与V3KO小鼠的主动脉的血管张力变化均无明显差异。4.V3WT与V3KO小鼠的血管内皮细胞中的NO含量无明显差异。5.给予L-NNA诱导的高血压模型小鼠血管组织中,TRPV3的表达明显高于正常血压小鼠。小结:1.TRPV3在大、中、小动脉中均有分布,在动脉平滑肌与内皮细胞中均有表达。2.敲除TRPV3的小鼠,动脉血压显著升高,血液NE含量显著升高。3.激动TRPV3降低V3WT小鼠动脉血压,抑制TRPV3升高动脉血压。4.V3WT与V3KO小鼠相比,其血管张力无明显差异、其内皮细胞NO含量无明显差异。结论:1.小鼠内耳毛细胞TRPV4和TRPV3保护小鼠的正常听力。TRPV3缺乏,TRPV4补偿性高表达仍可以维持正常听力,并保护听力避免卡那霉素诱导的药物性耳毒性。TRPV3缺乏,TRPV4表达下调则导致听力受损。2.TRPV3在大、中、小动脉的平滑肌和内皮细胞均有分布。TRPV3降低血压,TRPV3缺乏升高血压。TRPV3调节血压过程中,NO信号通路可能未参与。