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恶性黑色素瘤是最致命的皮肤癌,临床上对黑色素瘤的治疗效果差强人意。被用于治疗黑色素瘤的方法有很多,肿瘤免疫疗法作为新一代疗法一直备受关注。而其中,针对肿瘤抗原的特异性免疫疗法已经被证明可以在治疗黑色素瘤上有较好疗效。Survivin抗原是肿瘤相关抗原,是很有潜力的治疗靶标,诱导其特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）可能对黑色素瘤起到一定的治疗效应。此外,GM-CSF和CCL17这两种细胞因子可能对CTL功能的发挥起到重要的作用。因此,本论文研究Survivin特异性CTL联合GM-CSF和CCL17的抗肿瘤作用,旨在为临床上黑色素瘤的免疫治疗提供一定的参考和帮助。第一部分Survivin抗原表位的生物信息学分析及体外细胞学实验目的:通过三个网站运用生物信息技术分析鼠Survivin基因,随后培养Survivin特异性淋巴细胞。方法:利用三个在线网站BIMAS（https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hlabind/）、SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）和IEDB 3.0（http://www.iedb.org/）对鼠Survivin（Birc5）基因及编码氨基酸全序列的9氨基酸表位肽进行评分、预测,选择评分较高的肽进行合成,制成肽疫苗免疫正常小鼠,然后分离其脾脏淋巴细胞,诱导Survivin特异性CTL作用于小鼠黑色素瘤细胞B16F10,并在培养体系中加入GM-CSF和CCL17蛋白。通过Calcein-AM法和流式细胞术检测三者联合对B16F10细胞的作用。结果:筛选出Survivin66-74（GWEPDDNPI）和Survivin85-93（AFLTVKKQM）两个9肽,并成功诱导出了Survivin特异性CTL。而且,加入CCL17蛋白提高了CTL对B16F10的特异性裂解率,而加入GM-CSF蛋白则没有显著提高。结论:体外联合Survivin特异性CTL和CCL17对B16F10细胞有更强的杀伤作用,而联合GM-CSF并没有增强CTL对B16F10细胞的杀伤作用。第二部分构建稳定表达CCL17和GM-CSF的B16F10细胞系目的:构建稳定表达CCL17和GM-CSF的B16F10细胞系,为后续实验做准备。方法:设计GM-CSF和CCL17的引物,然后再通过一系列基因工程学的方法,将GM-CSF和CCL17基因导入到B16F10细胞中,并使其表达出来。结果:通过酶切、测序等等鉴定方法,我们证明了GM-CSF和CCL17被成功导入到表达载体中,并成功在B16F10细胞中表达。结论:成功构建表达CCL17和GM-CSF的B16F10细胞系,为后续实验奠定基础。第三部分Survivin特异性CTL联合CCL17和GM-CSF对小鼠黑色素瘤的影响目的:探讨过继性输注Survivin特异性CTL联合CCL17和GM-CSF对小鼠黑色素瘤的影响。方法:以小鼠黑色素瘤为模型,观察三者联合对肿瘤体积大小、肿瘤重量的影响,通过免疫染色和免疫组化等方法检测肿瘤局部淋巴细胞的浸润情况。结果:Survivin特异性CTL联合CCL17和GM-CSF可以更好抑制肿瘤生长效果;HE染色和免疫组化显示其肿瘤局部坏死的细胞最多,浸润淋巴细胞也较多。结论:体内实验证明Survivin特异性CTL联合GM-CSF和CCL17可以抑制小鼠黑色素瘤的生长。