论文部分内容阅读
目的:原发性肝癌（primary carcinoma of liver,PCL）是世界上第七大最常见的癌症。肝癌患者体内硒（selenium,Se）含量缺乏,足够的Se摄入量在保护肝细胞,减小肝癌发病率中发挥关键作用。然而,Se在生物体内能够使用的安全范围很窄,很容易因使用过量而造成中毒,因此,探究与研发安全的Se形态,降低Se的毒性至关重要。近年来,有关纳米硒（Nano selenium,Se NPs）的研究备受关注。与传统的Se形式相比,Se NPs由于其独特的尺寸效应和表面效应而具有更低的毒性和较好的生物利用度。使用还原剂来还原亚硒酸盐和硒酸盐是制备得到Se NPs的最常用的方法,但以这种方法制备的Se NPs的表面缺少邻近配位的原子,因此活性较高,在常温下不稳定,很容易发生聚集形成毒性更大的单质Se。因此,在制备Se NPs的过程中一般会使用分散剂来增加Se NPs的分散性。多糖类分子结构中具有羟基,能通过分子间氢键与Se结合,防止Se NPs聚集,因此多糖常被用于分散Se NPs。党参（Codonopsis pilosula）是一种常用的补益中药,多糖是其主要药理活性成分之一。现代研究发现,党参多糖具有抗氧化、抗炎、抗应激等多种药理活性。目前对于党参多糖的在结构特征和药理活性方面的研究较多,关于利用党参多糖修饰Se NPs的报道几乎没有。因此,利用党参多糖修饰Se NPs,提高硒的利用价值是比较有创新性的研究热点。综上所述,本研究从中药党参中提取纯化得到党参多糖,在阐明党参多糖的结构后,运用党参多糖作为分散剂,利用化学还原法合成党参多糖/纳米硒复合物,以解决Se NPs易聚集的问题。对党参多糖/纳米硒复合物的结构和稳定机制进行表征和探索,以期为党参多糖/纳米硒复合物的合成提供实验基础。最后,结合Se NPs的药理活性,从细胞增殖和凋亡的角度,运用药理学方法探究党参多糖/纳米硒复合物的抗肝癌活性,并阐明其作用机理,以为党参多糖/纳米硒复合物治疗肝癌提供理论和实验依据。方法:1党参多糖的提取分离与结构表征:运用水提醇沉法得到党参粗多糖（CP）;利用元素分析仪分析CP的纯度;运用苯酚-硫酸法测定CP的糖含量;运用凝胶柱色谱法（HPGPC）进一步纯化CP得到党参多糖CPW1;运用HPGPC测得CPW1的Mp、Mw和Mn;运用离子色谱法（IC）检测CPW1的单糖组成;运用傅里叶红外光谱（FT-IR）来分析CPW1的官能团;运用气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测CPW1糖苷键的连接类型;运用一维和二维核磁（NMR）分析CPW1的化学结构。2党参多糖/纳米硒复合物（CPW1-Se）的制备与结构表征:以CPW1作为分散剂,以不同浓度的Na2Se O3为原料,抗坏血酸为还原剂,利用化学还原法获得复合材料（CPW1-Se）,分别表示为CPW1-Se0.1、CPW1-Se0.2和CPW1-Se0.4。采用透射电子显微镜（TEM）和髙分辨率透射电子显微镜（HRTEM）来观察CPW1、Se和CPW1-Se的形貌;使用FT-IR测定CPW1-Se的FT-IR光谱图;利用动态光散射（DLS）测量CPW1-Se的粒径和zeta电位;将CPW1-Se0.1、CPW1-Se0.2和CPW1-Se0.4置于室温环境中15天,通过DLS测量各组粒径和Zeta电位;通过X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）探索CPW1-Se0.2的稳定机制;利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测量CPW1-Se0.2中Se的含量。3 CPW1-Se抗肝癌活性及机制:选取人肝癌Hep G2、Huh-7细胞为研究对象,探索CPW1-Se的抗肝癌活性及作用机制。运用CCK-8法检测CPW1、Se NPs和CPW1-Se分别对人肝癌细胞和人胚肾293T细胞活力的影响;运用平板克隆法研究CPW1-Se对肝癌细胞增殖的影响;运用流式细胞术研究CPW1-Se对肝癌细胞和人胚肾293T细胞细胞周期的影响;运用流式细胞术研究Se NPs对人胚肾293T细胞细胞周期的影响;运用蛋白质印迹法研究CPW1-Se对肝癌细胞和人胚肾293T细胞周期和凋亡相关蛋白表达水平的影响。结果:1 CP的元素分析结果显示CP中只有0.265%的N含量,这说明CP中不存在蛋白质;苯酚-硫酸法结果显示,CP中糖含量为96.8%;运用HPGPC测得CPW1的Mp、Mw和Mn的计算分子量分别为5205、5623和4424。运用IC检测出CPW1中含有葡萄糖和果糖这两种单糖,且二者的摩尔比为0.121:0.879;运用GC-MS检测出CPW1为果聚糖,且其主要连接方式为→1)-Fruf-(2→（93.24%）;结合核磁分析检测出CPW1的结构式为α-D-Glcp-1→（2-β-D-Fruf-1）n→2-β-D-Fruf（n=35-36）。2通过TEM和HRTEM观察到CPW1在水中表现为一条类似蠕虫的短链;在形成Se NPs的过程中,如果没有添加CPW1,那么合成的Se NPs之间容易发生相互作用而聚集,形成直径为300-500 nm的颗粒;在制备过程中增加CPW1浓度,那么所合成的Se NPs会越来越倾向于分散;当CPW1的浓度恒定为5 mg/m L时,随着Na2Se O3浓度的增加,所制备得到的Se NPs的平均尺寸就从54 nm增加到79 nm;将CPW1-Se0.1、CPW1-Se0.2和CPW1-Se0.4置于室温环境中15天后,CPW1-Se0.4的粒径在第7天和第15天时都有所增大,CPW1-Se0.1和CPW1-Se0.2的粒径大小在15天内保持相对稳定;与第一天所测的zeta电位相比,CPW1-Se0.1和CPW1-Se0.4的zeta电位都有所减小,而CPW1-Se0.2的zeta电位在15天内保持相对稳定;XPS结果表明Se NPs优先与多糖的OH基团相互作用形成Se-O键;XRD结果表明CPW1-Se和CPW1的XRD光谱存在显著差异;CPW1-Se的HRTEM图像中没有显示晶格平面,SAED图案中没有显示出衍射环。上述结果表明,Se NPs与多糖融合,最终获得无定形CPW1-Se。3 CCK-8结果显示,CPW1对人肝癌Hep G2、Huh-7和人胚肾293T细胞基本上都没有毒性;Se NPs使用浓度＜20μg/m L时,对人肝癌Hep G2、Huh-7细胞和人胚肾293T细胞毒副作用并不明显;与CPW1和Se NPs相比,CPW1-Se对人肝癌Hep G2、Huh-7细胞活力抑制作用更加显著,并且它在给药浓度＜200μg/m L时具有增强人胚肾293T细胞细胞活力的作用。平板克隆结果显示,CPW1-Se可显著抑制肝癌细胞增殖;细胞周期结果表明,CPW1-Se可通过抑制增殖相关蛋白cyclin A2的表达诱导人肝癌Hep G2、Huh-7细胞细胞周期阻滞于S期;CPW1-Se可通过上调cyclin A2和cyclin B1的蛋白表达水平来促进人胚肾293T细胞的细胞周期,从而促进细胞增殖;Se NPs对人胚肾293T细胞细胞周期没有影响;蛋白免疫法检测凋亡相关蛋白结果显示:CPW1-Se可降低人肝癌细胞中PARP和Bcl-2的蛋白表达水平,升高Cleaved Caspase 9和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平,表现为促进凋亡的作用;而当CPW1-Se给药到人胚肾293T细胞后,PARP和Bcl-2的蛋白表达水平显著升高,Cleaved Caspase 9和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平显著降低,表现为抑制凋亡的作用。结论:1利用水提醇沉法提取纯化党参多糖,提取条件温和,成本较低,所得党参多糖纯度较高。经检测,CPW1是一种菊粉型果聚糖,结构式为α-D-Glcp-1→（2-β-D-Fruf-1）n→2-β-D-Fruf（n=35-36）。2在Se NPs的合成过程中,利用CPW1作为分散剂能很好地分散Se NPs。3 CPW1-Se能通过抑制人肝癌细胞的细胞周期,促进人肝癌细胞的凋亡来发挥抗肝癌作用,并且它可以促进人正常细胞的增殖,抑制细胞凋亡,具有明显的安全性。