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研究背景:肺癌在男性和女性的发病率都处于肿瘤相关性疾病的前列。我国确诊为肺癌的患者当中,非小细胞肺癌（NSCLC）患者大概有8成,近年常规的化疗方案是铂类为主,联合另外一种化疗药物（吉西他滨、培美曲塞等）,但是临床治疗效果不佳,部分患者容易出现化疗耐药。靶向药物横空出世,提高了非小细胞肺癌患者的存活率。靶向药物在使用当中出现了耐药,部分患者用药之后出现各类型的基因突变,导致耐药问题,继而减轻药物治疗效果,因此临床上目前迫切需要开发新的靶向药物来解决相应治疗问题。腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）作为真核生物当中的一类蛋白激酶,不易发生突变,性质极为稳定,作为各类细胞中ATP代谢过程当中的重要蛋白,发挥调控细胞代谢的作用。AMPK与单磷酸腺苷结合或172位苏氨酸（Thr）被磷酸化而激活。AMPK最经典的激活蛋白就是抑癌基因LKB1,在非小细胞肺癌当中,LKB1的突变也和非小细胞肺癌发生发展具有相关性,LKB1的杂合性或纯合性缺失发生在绝大多数非小细胞肺癌当中。本研究目的是探讨AMPK的激活能够表现出对非小细胞肺癌的抑癌作用。本研究内容是探讨小分子ASP4132作为AMPK的激活剂在动物以及体外对非小细胞肺癌细胞系的抑癌作用机制。分为以下几个部分:第一部分:小分子ASP4132对非小细胞肺癌细胞系的增殖、迁移、周期等表型影响;第二部分:ASP4132对非小细胞肺癌细胞系的抑癌机制探索。第三部分:ASP4132动物实验。综上所述,ASP4132在小鼠和体外通过激活AMPKα来产生抑制肿瘤的作用。第一部分小分子ASP4132对非小细胞肺癌细胞系的增殖、迁移、周期等表型影响目的:探讨ASP4132在体外对非小细胞肺癌细胞株的抑癌作用方法:1.CCK-8法和5-溴-2-脱氧尿嘧啶法、克隆集落实验。2.流式细胞仪测周期。3.Transwell细胞迁移实验。结果:1.不同浓度梯度药物（0.1u M、0.3u M、1u M、3u M）处理后,与对照组相比,非小细胞肺癌细胞株的生长受到了抑制,1u M ASP4132作用48h,细胞活力下降至65%,72h下降至41%,96h下降至30%。0.3u M-3u M的药物都产生了明显生长抑制作用,但是没有抑制正常支气管上皮细胞的生长。药物具有时间依赖性,作用96h较24h有明显的统计学差异。加药组对比对照组,减少了侵袭和迁移的细胞数目,迁移细胞从114.12±10.02个细胞下降至35.66±2.48个细胞。2.克隆集落形成实验显示:0.3u M-3u M的药物产生了较为明显的克隆集落减少。3.流式细胞仪测周期:与对照组相比,药物处理后,处于S期的细胞占比自42.26±3.15%下降至30.11±2.77%。结论:ASP4132在体外具有明显抑癌作用,能够减少非小细胞肺癌细胞增殖和迁移、侵袭能力,并且对正常支气管上皮细胞没有明显药物毒性。第二部分ASP4132对NSCLC细胞的作用机制探索目的:探讨ASP4132对非小细胞肺癌抑癌作用的具体机制方法:1.Caspase-3活性检测以及蛋白检测、单链DNA抗体ELISA检测。2.原位末端标记（TUNEL）法和Hoechst3342共染检测细胞凋亡、Annexin V检测细胞凋亡。3.Z-DEVD-FMK以及Z-VAD-FMK药物抑制实验。4.线粒体蛋白提取和免疫共沉淀检测、JC-1线粒体膜电位染色、乳酸脱氢酶检测（LDH）。5.环孢素A以及Cy PD敲减实验,进行细胞系回复实验。6.AMPKα的Western Blots和体外活性检测。7.自噬斑检测。8.sh-AMPK处理非小细胞肺癌细胞、构建AMPKα休眠体以及构建AMPKα1持续激活细胞系。结果:1.与对照组相比,药物组的caspase-3的活性明显出现了增加,cle-caspase-3的表达出现了明显增加,并且cle-PARP的蛋白表达水平也出现了增加。与对照组相比,药物组的细胞内单链DNA抗体自0.05增加至0.31±0.03,差异有统计学意义。TUNEL阳性细胞数目自4.41±0.91%增加到24.90±3.06%,差异有统计学意义。与对照组相比,药物刺激组使用流式细胞仪检测提示凋亡细胞占比从3.92±0.68%升高至19.17±3.22%,差异有统计学意义。2.ASP4132诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡依赖于caspase家族的激活。3.ASP4132药物组,出现了Cy PD-P53-ANT1蛋白的相互结合并且伴有线粒体膜结构电位改变和LDH释放增加。4.ASP4132的抑癌作用依赖于Cy PD诱导的程序性坏死过程。5.ASP4132明显的在体外细胞实验中激活了AMPKα1,导致p-S6K1表达减少,总的S6K1没有明显改变;EGFR以及PDGFR蛋白明显减少,下游激活的Akt也出现减少。6.自噬斑增多。7.AMPK敲减后,ASP4132对非小细胞肺癌细胞的抑制作用被回复;与对照组相比,加药组中,不能被激活的AMPKα1休眠体非小细胞肺癌细胞稳转株的抑癌作用会被回复;激活状态的AMPKα1能够显著的抑制非小细胞肺癌细胞株的增殖,诱导非小细胞肺癌细胞死亡。结论:ASP4132在体外依赖于AMPKα1的激活发挥抑癌作用,能够通过参与Cy PD-P53-ANT1介导的程序性坏死、caspase家族介导的凋亡等多种途径抑制非小细胞肺癌细胞的体外增殖、生长。第三部分ASP4132动物实验验证目的:利用小鼠构建异种肿瘤模型,验证ASP4132小分子药物的抑癌作用方法:用5周龄的严重联合免疫缺陷小鼠（一半雄性,一半雌性）,体重在18.5g-19.5g。每只小鼠种植3×10~6非小细胞肺癌细胞于腹腔皮下,最后对肿瘤进行组织蛋白提取,利用Western Blots进行蛋白表达检测。结果:口饲ASP4132的实验组,肿瘤体积明显缩小、肿瘤重量明显出现减轻。结论:ASP4132口饲小鼠能够产生明显抑制肿瘤增长的作用,并且小鼠并未出现明显不良反应。