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近年来,国外文献报道了一些全身免疫系统功能减弱或缺陷的患者因为暴露于微生物污染的口腔科用水而发生医源性感染的病例。然而国内尚未对口腔医师诊治病人的基本设备口腔综合治疗台(Dental chair unit,DCU)的水质用水制定标准,对于口腔综合治疗台水路系统(Dental unit waterlines,DUWLs)中细菌微生物群落构成和多样性的研究尚不足。本研究拟将PMA与高通量测序技术相结合来深入探究DUWLs中的活菌微生物群落构成及多样性,这有助于规避可能出现的相关感染风险以及更好的采用相应的消毒设备处理和保护DUWLs。本研究从下述二个部分对这一问题进行探讨。1.PMA-PCR检测口腔综合治疗台水路系统活菌方法的建立目的:利用叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)染料与聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术相结合建立DUWLs活菌检测方法。方法:PMA前处理水样,使PMA与样本中死菌和游离的DNA发生共价交联后可抑制其DNA分子进行PCR扩增。经细菌通用引物对提取的细菌基因组DNA进行PCR扩增,以确定PMA最适处理浓度。结果:对于热处死组水样,随着PMA浓度的增加,条带逐渐变暗,直至PMA终浓度为20μM时,条带完全消失。说明PMA能够与样本中死菌DNA发生反应并抑制其进行PCR扩增。对于未进行热处死处理的常规水样样本,随着PMA浓度的增加,条带未见明显变暗或消失。说明对于常规水样样本,即使增加PMA浓度至30μM也不会影响正常活菌的PCR扩增。结论:当样本中PMA终浓度为20μM时,对水样活菌DNA的PCR扩增无影响,并可抑制水样中全部死菌及游离DNA进行扩增。经PMA处理后的水样后继可用高通量测序的方法对其活菌群落构成进行检测。2.口腔综合治疗台水路系统活菌微生物群落的构成和多样性研究目的:采用PMA前处理方法结合高通量测序技术检测DUWLs中活菌微生物群落,以综合评估DUWLs中的污染情况及了解活菌群落构成及多样性。方法:选择南京医科大学附属口腔医院牙体牙髓科和牙周科共33台口腔综合治疗台(Dental chair units,DCU)作为研究对象。在医院开诊前收集三用枪水样200mL,PMA前处理水样后提取活菌总DNA,经细菌通用引物PCR扩增后构建宏基因组文库,用于高通量测序和生物信息学分析。结果:33个样本成功构建宏基因组文库,经高通量测序,共得到978054条高质量序列。检测到12128个OTU,归属于18个门,100个属;其中属包括52个菌属,23个暂定种以及25个未被分类或是尚未被培养出的菌属。稀释性曲线、香农-威纳曲线表明测序数据量合理,能够覆盖样本99%的物种,表明测序结果能够代表这些样本的真实情况。PCoA结果显示,两个科室样本组内分布类似呈聚集趋势,组间呈分离趋势;说明科室间的微生物群落构成存在一定的差异。由Venn图可见两组共有和特有OTU数量,表明两个科室DUWLs中存在共同核心微生物。其中栖热菌属(Thermus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、军团菌属(Legionella)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Reyranella菌属是所有样本主要的共同核心菌属。两个科室样本比较,军团菌属(Legionella)、Methyloversatilis、Obscuribacterales—norank 差异有统计学意义(P<0.05)。共检测出4种条件致病菌属:军团菌属(Legionella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas),检出率为100%。结论:本研究用高通量测序方法检测出的DUWLs活菌多样性的信息要远远丰富于以往培养和其他分子生物学方法的检测结果。栖热菌属(Thermus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、军团菌属(Legionella)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Reyranella可能是DUWLs的核心菌群。四种条件致病菌的检出说明潜在传染性风险的存在,临床上监测DUWLs细菌污染水平及更好地管理DUWLs水质尤为重要。