论文部分内容阅读
Collagen XV(Col XV)是胶原家族的成员之一,分布在细胞基底膜表面,在动物生理和病理过程中发挥重要作用。Col XV与Col XVIII组成MULTIPLEXINs/内皮抑素产生的胶原蛋白亚类,它们结构上高度保守,在血管生成、炎症发生、肿瘤形成和脂肪代谢等方面具有类似功能。研究发现Col XVIII促进脂肪细胞分化,增加内脏脂肪的堆积,增加组织重构,维持能量稳态。Col XV在成脂分化过程中表达上调,参与组织再生、能量稳态和肥胖相关疾病的调节,然而Col XV对脂肪细胞分化的调节及其分子机制还有待研究。本研究为了明确Col XV调控脂肪细胞分化的作用机制,在脂肪细胞中超表达和干扰Col XV,得到以下结果:1.Col XV促进脂肪细胞分化和抑制脂质分解。Col XV在腹股沟白色脂肪、附睾白色脂肪的表达丰度较高,而在肩胛棕色脂肪、肝脏、肌肉和心脏等组织中的表达丰度较低,其中白色脂肪组织中Col XV的表达极显著高于棕色脂肪中的表达(P<0.01)。在高脂饮食(HFD)诱导下,Col XV在腹股沟白脂、附睾白脂和棕脂中的表达均极显著提高(P<0.01)。在脂肪细胞中,随着C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表达上调,Col XV的表达极显著上升(P<0.01),而CREB的表达显著下降(P<0.05)。油红O和Bodipy染色发现,Col XV促进脂肪细胞分化,加速脂肪细胞内脂滴的积累。超表达Col XV在0d、4d和8d显著促进脂肪细胞分化标志基因C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表达,干扰Col XV后作用相反(P<0.05)。超表达Col XV促进脂合成基因ACCα和FASN的表达,抑制脂分解基因HSL、LPL和ATGL的表达(P<0.05),干扰Col XV后上述基因表达相反。超表达Col XV降低细胞中cAMP和p-PKAThr197的水平,Forskolin逆转这种抑制作用,H89则加强这种抑制作用,干扰Col XV后则激活了cAMP/PKA信号通路。表明Col XV通过抑制cAMP/PKA信号通路促进脂肪细胞分化和抑制脂解。2.Col XV通过CREB负转录调控脂肪细胞分化和脂代谢。通过构建长度递减的Col XV启动子荧光素酶报告载体和CREB结合位点(CRE)定点突变的荧光素酶报告载体,双荧光素酶活性分析发现CREB结合在Col XV启动子上-354 bp~-334 bp处,抑制Col XV的转录活性。油红O染色发现超表达Col XV促进脂肪细胞脂质积累,干扰Col XV降低了脂质生成,CREB激动剂Forskolin处理后使脂滴消融。超表达Col XV促进C/EBPβ、PPARγ和FABP4等的基因表达,干扰Col XV抑制脂分化基因的表达,而Forskolin处理进一步降低了它们的表达。超表达Col XV促进FASN和ACCα的表达,抑制HSL的表达,Forskolin逆转了超表达Col XV对脂代谢的作用。干扰Col XV降低FASN和ACCα的表达,提高HSL的表达,Forskolin增强了干扰Col XV后的作用。表明Col XV通过CREB负转录调节它的启动子活性,进而影响脂肪细胞分化和脂代谢。3.Col XV通过DNA甲基化调节脂肪细胞分化和脂代谢。采用亚硫酸氢盐测序法发现在脂肪细胞分化后Col XV的DNA甲基化水平降低,Col XV的表达水平升高,甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)和CpG结合蛋白3(Mbd3)的mRNA表达显著降低。在脂肪细胞分化第0 d和4 d,Col XV超表达后抑制了Dnmt1的表达,甲基转移酶抑制剂5-azacytidine(5-Aza-dC)加剧了这一作用,对Dnmt3a和Dnmt3b的作用不显著。5-Aza-dC抑制Col XV的DNA甲基化水平,促进它的mRNA表达。在脂肪细胞分化第0 d,Col XV超表达促进C/EBPβ、PPARγ的表达,5-Aza-dC显著降低C/EBPβ、PPARγ的表达;而第4 d在Col XV甲基化被抑制后Col XV上调的C/EBPβ和PPARγ的表达被进一步增强。在脂肪细胞分化第0 d和第4 d,超表达Col XV抑制HSL的mRNA表达,在Col XV甲基化水平降低后加剧了这种抑制作用。油红O结果一致,在分化的脂肪细胞中超表达Col XV促进脂沉积,干扰Col XV抑制脂沉积,Col XV甲基化被抑制后加速了脂肪细胞内脂滴形成。表明Col XV通过DNA甲基化下调来促进脂肪细胞分化和抑制脂肪细胞的分解代谢。综上所述,本试验表明Col XV通过抑制cAMP/PKA信号通路来促进脂肪细胞分化和抑制脂质分解,并证实Col XV通过CREB的负转录调控和DNA甲基化抑制来促进脂肪细胞分化和抑制脂肪细胞分解代谢。