蒸馏酒是各国人民熟知并喜爱的酒精饮品,营养价值高并用途广泛。蒸馏酒是由微生物和含淀粉、糖质的原料酿造并经过蒸馏而得到。在酿造过程中,随着酿酒酵母的自身代谢和原料的分解,既会产生一些营养物质或者香味物质,也会生成一些对饮用者身体健康有不良影响的物质,如异戊醇等。异戊醇及高级醇含量过高会使饮用者有“上头”的不适感等一些不舒服的反应。蒸馏酒中的异戊醇一部分是经原料水解得到的,一部分是经酵母代谢产生。酵母代谢生成异戊醇有两种途径:一是转氨基作用,Erlich途径;二是糖代谢途径,Harris途径。编码类丙酮酸脱羧酶的THI3基因是Erlich途径中的关键基因;编码β-异丙基苹果酸脱氢酶的LEU2基因是Harris路径中的关键基因。本实验用华南理工大学生物学院实验室保存的一株低甲醇酵母菌株S₁为出发菌株,选用基于PCR技术的Cre-Loxp重组酶系统与酵母电转化法构建了一株THI3基因完全缺失的酵母菌株S₂,并将菌株S₁和菌株S₂分别采用麦芽汁浓度为13°P,接菌量3%,30℃恒温发酵6d,并用气相色谱法和酒精计分别测出其蒸馏酒中的相对异戊醇含量和20℃的酒精含量为:菌株S₁发酵后的相对异戊醇含量为1.13g/L,20℃下的酒精含量为10.0%vol,菌株S₂发酵后的相对异戊醇含量为0.81g/L,20℃下的酒精含量为10.5%vol。由此可见,敲除THI3基因的菌株S₂发酵后蒸馏酒中的相对异戊醇含量比菌株S₁降低了28.3%,并且酒精含量有所提高,发酵性能良好。在菌株S₂的基础上成功敲除LEU2基因,构建了一株THI3基因和LEU2基因完全缺失的酿酒酵母菌株S₃,并采用上述完全一致的条件发酵,测得菌株S₃发酵后的蒸馏酒中相对异戊醇含量为0.70 g/L,比菌株S₂降低了13.6%,比酵母菌株S₁降低38.1%,酒精含量为8.0%vol,相比于菌株S₁和菌株S₂都有所降低,酒精发酵性能不佳。选用菌株S₂作为最优的发酵菌株,进行液态和半固态发酵工艺探究,实验结果表明:液态发酵时,当麦芽汁浓度为15°P、发酵时间为5d、发酵温度为30℃、接菌量为3%时发酵产异戊醇含量最低;在半固态发酵时,发酵原料为高粱时,生成异戊醇相对含量为最低,为0.77g/L,发酵原料为大米和高粱的混合物时生成的异戊醇相对含量最高,为0.85g/L,而当用稻谷作为发酵原料后生成的相对高级醇含量最低,为1.49g/L;当用大米和高粱的混合物为发酵原料后生成的相对高级醇含量最高,为1.72g/L。