【摘 要】
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玉米作为重要的粮食和饲料作物以及工业用途原料在我国大面积种植,种植面积和产量居三大作物之首,对保证粮食安全具有重要意义。病害是影响玉米生产的主要因素之一,常年损失6%～10%。玉米茎腐病又称玉米青枯病,是一种典型的土传性病害,该病害由多种病原菌单独或复合侵染引起,其中禾谷镰刀菌是分布最广、致病力最强的玉米茎腐病优势病原菌。近年来,虽然鉴定到了几个玉米茎腐病的数量抗性位点,但是抗性贡献率都有限,而且
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玉米作为重要的粮食和饲料作物以及工业用途原料在我国大面积种植,种植面积和产量居三大作物之首,对保证粮食安全具有重要意义。病害是影响玉米生产的主要因素之一,常年损失6%～10%。玉米茎腐病又称玉米青枯病,是一种典型的土传性病害,该病害由多种病原菌单独或复合侵染引起,其中禾谷镰刀菌是分布最广、致病力最强的玉米茎腐病优势病原菌。近年来,虽然鉴定到了几个玉米茎腐病的数量抗性位点,但是抗性贡献率都有限,而且玉米茎腐病的抗性分子机理我们还知之甚少,因此,挖掘新的玉米茎腐病抗性基因及研究其抗性机理,对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。本研究通过对禾谷镰刀菌侵染玉米前后进行蛋白质组学分析,鉴定到一些与茎腐病抗性相关的差异蛋白,并对其中一个差异蛋白Peroxiredoxin5（Zm-Prx5）进行了后续研究。通过对Zm-Prx5进行表达分析、亚细胞定位及转基因玉米的功能分析,对揭示玉米茎腐病抗性的机理以及玉米茎腐病抗性育种提供了一定的理论基础。本文主要研究内容如下:1、利用TMT标记技术对禾谷镰刀菌（玉米茎腐病主要致病菌）侵染玉米前后的蛋白质组学分析,共筛选出了763个差异蛋白,GO富集和KEGG富集分析表明,这些差异蛋白参与了广泛的生物学过程,其中活性氧清除相关蛋白显著富集,暗示着活性氧清除途径在玉米茎腐病抗性中起着至关重要的作用。我们进一步选取了一个活性氧清除途径中的差异蛋白（Zm-Prx5）进行了后续研究。2、通过电子克隆的方法,对Zm-Prx5基因进行了克隆,获得了其c DNA序列,ORF具有一个486bp的编码框,编码162个氨基酸,编码蛋白预测的分子量是17.4KDa,等电点4.99,且其DNA具有3个外显子,2个内含子;系统进化分析表明,Zm-Prx5与高粱的peroxiredoxin-2C蛋白进化关系最近,位于同一进化分支上,其次是谷子和黍,和水稻相对较远;通过组织表达分析发现,Zm-Prx5在玉米各组织间均有表达;利用q RT-PCR技术研究了Zm-Prx5在激素SA、禾谷镰刀菌处理下的表达模式,结果表明,SA和禾谷镰刀菌都可以显著诱导Zm-Prx5的表达,这暗示着Zm-Prx5可能在玉米茎腐病抗性中发挥着重要作用。3、通过DNA重组技术,构建了带有GFP标记的荧光表达载体pCAMBIA1304-Zm-Prx5,分别将构建好的荧光表达载体p CAMBIA1304-Zm-Prx5及空载体p CAMBIA1304转化到玉米原生质体中诱导表达,共聚焦显微镜观察玉米原生质体中的荧光信号,结果表明Zm-Prx5是一个细胞质定位蛋白。4、通过DNA重组技术,成功构建了Zm-Prx5的过表达载体,并通过农杆菌介导的方法将其转化到HiⅡ愈伤组织中,通过筛选、诱导成苗及后代鉴定得到T4代稳定遗传的转基因玉米株系,通过对转基因玉米进行q RT-PCR和Western blot检测,证实Zm-Prx5在转基因玉米中稳定、过量表达;表型鉴定发现,相对于阴性对照株系,Zm-Prx5过表达转基因株系在人工接种禾谷镰刀菌后病斑扩展速度显著降低,证明Zm-Prx5的过表达可以增强玉米对茎腐病的抗性;病原切片结果显示,转基因阳性株系茎秆组织中的菌丝数量显著少于阴性株系,且阳性株系茎秆组织细胞完整,菌丝仅沿着薄壁细胞间生长;而阴性株系的茎秆组织薄壁细胞出现破损,菌丝已经生长至细胞内部,进一步证实了Zm-Prx5在玉米茎腐病抗性中的作用;为了探究Zm-Prx5的抗病机制,我们首先进行了H2O2含量的测定,结果表明,在接种禾谷镰刀菌后转基因阳性株系显著低于阴性株系,说明Zm-Prx5可能通过调节玉米植株内的活性氧平衡,提高了玉米对茎腐病的抗性;进一步对抗病相关基因的表达模式进行了q RT-PCR分析,结果表明,接种禾谷镰刀菌后,Zm-Prx5过表达转基因株系中抗病相关基因PR1、PR4、ERF21、ACC1、NPR5和NPR4的表达量显著高于阴性对照,说明Zm-Prx5可能通过调控玉米体内活性氧的平衡,进而调控防卫基因的表达来增强玉米对茎腐病的抗性。
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