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雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)又称雷公藤甲素,是从卫矛科雷公藤属中分离到的主要有效成分,系二萜内酯化合物,药理活性强,具有抗炎、抗生育和免疫调节等作用,能抑制多种肿瘤细胞的增殖,具有广泛的抗瘤谱,还能增加肿瘤对化疗药物的敏感性,是比较有前途的抗肿瘤药物。但其毒性较大,安全范围较窄,妨碍了其在临床上的进一步推广。本单位的前期研究发现TPL对人结肠癌等消化道肿瘤的裸鼠移植模型具有较强的抗癌作用,强于临床上消化道肿瘤常用的化疗药物。由于在临床上对消化道常见实体瘤的化疗通常由一个以上的化疗药组成合理的化疗方案进行治疗。因此,在深入探讨TPL的作用特点与作用机制的基础上寻找与TPL具有协同作用的抗癌药物联合应用于消化道肿瘤的治疗,既降低TPL使用剂量又发挥其抗癌效应,就成为现在急需解决的主要问题。尽管文献报道,雷公藤内酯醇抗肿瘤作用可能通过多种机制,但其确切的抗癌机制仍未十分明确。因此,我们认为有必要对雷公藤内酯醇及其与其它抗癌药联合作用抗肿瘤的机制进行深入探讨。一、雷公藤内酯醇体外抗结肠癌细胞SW480作用及相关机制的研究为了探讨TPL抑制SW480细胞增殖和诱导凋亡的作用特点与作用机制,分别研究了TPL对拓扑异构酶、微管蛋白、HSP70及与其相关的细胞增殖和凋亡信号分子的影响。研究方法:(1)用MTT法观察雷公藤内酯醇对细胞增殖的影响;(2)用集落形成法观察TPL对细胞集落形成的影响;(3)用AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率;(4)从SW480细胞中提取含有的TOPO I、TOPO II粗酶溶液用于实验,通过TOPO I、TOPO II介导的负超螺旋pBR322质粒解旋反应检测TPL对TOPO I、TOPO II酶活性的影响;(5)用浊度法检测,TPL对提取的猪脑微管蛋白体外聚合反应的影响;(6)分光光度法检测TPL对细胞caspase-3和caspase-9活性的影响;(7)用RT-PCR半定量法检测TPL对SW480细胞HSP70 mRNA的影响;(8)用Western blot方法观察TPL对热休克蛋白70(HSP70)及与细胞增殖和凋亡有关信号分子的影响;(9)用AO-relocation法、AO-uptake法观察TPL对溶酶体结构的影响;(10)SB203580预处理对TPL诱导SW480细胞增殖抑制和凋亡的影响。结果显示:(1)TPL抑制SW480细胞增殖,呈时间和剂量依赖关系,TPL作用48小时,IC50约为14.14ng/ml;(2)TPL影响SW480细胞的集落形成,呈量效关系;(3)TPL诱导SW480细胞凋亡,呈剂量依赖关系;(4)TPL在有效浓度对SW480细胞TOPO I的酶活性无明显影响;当TPL浓度高达到400μg/ml时,才能够抑制SW480细胞TOPO II的酶活性;(5)TPL 0.1~10μg/ml不抑制体外微管蛋白的聚合,相反有一定促进微管蛋白聚合的趋势,但是差异不显著;(6)TPL在有效浓度能增加细胞caspase-3和caspase-9的活性;( 7)TPL在有效浓度能下调HSP70 mRNA和蛋白表达,且呈量效及时效关系;(8)TPL在有效浓度能下调p53、c-myc、Bcl-2和p-Erk1/2蛋白含量;上调Bax蛋白和p-p38蛋白含量;不影响Erk1/2蛋白的表达;(9)SW480细胞经TPL处理后溶酶体结构受到一定程度的破坏;(10)p38特异性抑制剂SB203580部分阻断TPL对SW480细胞的增殖抑制和凋亡作用。二、雷公藤内酯醇与奥沙利铂合用对SW480细胞的抑制作用及相关机制的研究结肠癌治疗产生耐药的原因之一,是化疗药物诱导细胞大量表达HSP70,TPL在体外对SW480细胞产生抗癌作用的同时可下调HSP70,这一特点提示,TPL与结肠癌治疗的常用药奥沙利铂(Oxaliplatin, OXA)联合应用可能具有协同效应。本研究观察TPL与OXA联合对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响;观察TPL与OXA合用对HSP70以及与细胞增殖和凋亡有关的信号分子的影响。研究方法:(1)用MTT法观察TPL与OXA联合对细胞增殖的影响;(2)用集落形成法观察TPL与OXA联合对细胞集落形成的影响;(3)用流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)检测TPL与OXA联合对细胞凋亡的影响;(4)分光光度法检测TPL与OXA联合对细胞caspase-3和caspase-9活性的影响;(5)用Western blot方法观察TPL与OXA联合对热休克蛋白70(HSP70)及与细胞增殖和凋亡有关信号分子的影响;(6)SB203580预处理对TPL与OXA联合诱导SW480细胞增殖抑制和凋亡的影响。结果显示:(1)TPL与OXA协同抗SW480细胞增殖,作用48 h的协同指数CI<1.1;(2)TPL协同OXA抗SW480细胞集落的形成(CI < 0.9);(3)TPL与OXA协同诱导SW480细胞的凋亡;(4)TPL与OXA协同增加细胞caspase-3和caspase-9的活性;( 5) OXA能上调SW480细胞的HSP70的水平,TPL与OXA联用后可下调OXA增高的HSP70水平,还可减少细胞原有的HSP70水平;(6)TPL协同OXA下调p53蛋白的表达,还可协同上调Bax、p-p38蛋白的表达;(7)TPL与OXA联合对p-Erk1/2、Erk1/2蛋白无明显影响;( 8) SB203580部分阻断TPL与OXA联合对SW480细胞的增殖抑制和凋亡作用。三、雷公藤内酯醇与奥沙利铂合用对SW480细胞裸鼠异种移植瘤的作用及相关机制的研究雷公藤内酯醇与奥沙利铂合用在体外可以协同抑制SW480细胞的生长并诱导细胞凋亡,那么二者对SW480细胞裸鼠移植瘤的增殖是否也有协同抑制作用,其中可能的机制又有哪些?研究方法:(1)建立SW480细胞裸鼠异种移植瘤模型;(2)实验设2%丙二醇生理盐水阴性对照组、雷公藤内酯醇组(0.1mg/kg)、奥沙利铂组(5mg/kg)、雷公藤内酯醇和奥沙利铂联合组(TPL 0.1mg/kg + OXA 5mg/kg),每组6只裸鼠。雷公藤内酯醇采用尾静脉给药,每2天给药一次,共7次;奥沙利铂采用腹腔给药,每3天给药一次,共5次。末次给药后24小时,处死裸鼠。称量离体瘤块重量、计算抑瘤率;(3)摘除眼球取血检测血常规及肝肾功能;(4)HE染色光镜下观察肿瘤组织的形态结构;(5)免疫组织化学检测TPL与OXA对肿瘤组织HSP70蛋白表达的影响;(6)免疫印迹检测TPL与OXA对肿瘤组织中HSP70、p53、Bax的蛋白表达的影响。结果显示:(1)低剂量TPL 0.1mg/kg对SW480细胞裸鼠异种移植瘤的抑制率为48.63%(p<0.01);TPL与OXA联合组的抑瘤率为59.6%(p<0.01);但是OXA单药组对荷瘤裸鼠的抑瘤率仅为9.66%;(2)给药后荷瘤裸鼠血常规及肝肾功能检测结果与阴性对照组比较无显著性差别;(3)免疫组化显示,阴性对照组和OXA单药组HSP70蛋白呈强阳性表达,TPL单药组和TPL与OXA联合组的HSP70蛋白表达明显减少,且联合组的HSP70表达弱于TPL单药组;(4)免疫印迹结果显示, TPL组和TPL+OXA联合组HSP70含量低于对照组,但OXA组却高于对照组;三个给药组p53蛋白含量均有所减少;三个给药组Bax的含量明显高于对照组。结论:1.TPL能抑制SW480细胞增殖,呈量效、时效关系,作用48 h IC50约为14.14ng/ml;TPL 8~100ng/ml作用48 h诱导SW480细胞凋亡,呈量效关系;2.TPL的浓度高达到400μg/ml时,能够抑制SW480细胞拓扑异构酶II的活性,但对拓扑异构酶I的活性无明显影响;3.TPL 0.1~10μg/ml不抑制体外微管蛋白的聚合,相反有一定促进微管蛋白聚合的趋势,但是差异不显著;4.TPL抑制SW480细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能与其下调HSP70的表达,并下调突变型p53、Bcl-2蛋白的表达和增强caspase-3、caspase-9、的Bax活性,以及对溶酶体结构的破坏有关;还可能与TPL促进Bax蛋白表达、激活p-p38 MAPK、抑制p-Erk1/2和c-myc有关;5.p38抑制剂SB203580能部分逆转TPL诱导的细胞凋亡,表明p38 MAPK的激活在TPL诱导凋亡中起重要作用;6.TPL协同OXA抑制SW480细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能与TPL能对抗OXA诱发的HSP70蛋白高表达,并下调突变型p53蛋白的表达和增强caspase-3、caspase-9、Bax的活性有关;还可能与TPL能协同OXA促进Bax蛋白表达、激活p38 MAPK有关;p38抑制剂SB203580能部分逆转TPL与OXA联合诱导的细胞凋亡,表明p38 MAPK的激活在TPL与OXA联合诱导凋亡中起重要作用;7.低剂量TPL能抑制SW480裸鼠异种移植瘤的生长;低剂量TPL与OXA联合对SW480细胞裸鼠移植瘤生长的抑制有相加的效应;且对裸鼠重要器官的毒性没有相应增加;其抗肿瘤机制可能与TPL协同OXA下调HSP70蛋白表达、抑制与其相关的突变型p53蛋白表达、上调Bax蛋白含量有关。