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卵巢癌在妇科恶性肿瘤中致死率高居第一位。卵巢癌起病隐匿,早期临床症状不明显,很难早期确诊,大部分患者在诊断时病情已进展至晚期。而晚期卵巢癌的五年生存率非常低。由于缺乏可靠的生物标志物,卵巢癌的早期诊断和预后都是亟待解决的临床难题。此外,虽然卵巢癌的放化疗以及靶向治疗不断发展,但由于低应答率、毒副反应以及耐药性等问题,仍有相当一部分卵巢癌患者难以从现有的治疗中获益。因此,寻找卵巢癌早期诊断生物标志物和预测患者预后情况的生物标志物,以及潜在的卵巢癌治疗靶点蛋白分子,成为卵巢癌诊断和治疗领域迫切需要解决的问题。最近几年,定量蛋白组学成为发现生物标志物应用最广泛的方法之一。定量蛋白组学通常用于癌症、心血管疾病及其它疾病新型生物标志物的发掘。通过患者尿液的研究,科学家已经发现了一个可区分良性与恶性卵巢肿瘤的蛋白质分子模块(包含WFDC2、PTMA、PVRL4、FIBA与PVRL2等五种蛋白质)。在本课题中,采用TMT蛋白组学方法,我们比较早期卵巢癌患者与晚期卵巢癌患者手术标本蛋白组学差异。分析结果显示,晚期卵巢癌相较于早期卵巢癌,差异表达的蛋白质分子一共有544个,其中455个蛋白质分子表达升高,89个蛋白质分子表达下降。差异蛋白最明显的生物进程主要包括MAPK信号通路、先天免疫反应、Ⅰ型干扰素信号通路、针对抗原刺激的炎症反应以及细胞增殖的调控通路等。差异蛋白KEGG通路主要集中在NF-kappa B信号通路、Focal adhesion信号通路、癌症转录调节异常与代谢通路等。我们筛选出前40个差异明显的蛋白质分子,利用生物信息学分析的方法,寻找到一个具有潜力的靶点蛋白分子LIMD2。通过GEPIA网站分析发现,LIMD2 m RNA在健康卵巢组织中低表达,而在卵巢癌病理组织中高表达。我们收集了60例卵巢组织石蜡切片,其中健康卵巢组织13例,卵巢癌Ⅰ期16例,Ⅱ期15例,Ⅲ期15例,Ⅳ期1例。我们对这60例组织切片进行针对LIMD2蛋白的免疫组化检测。结果显示,在健康卵巢组织中LIMD2呈阴性,在卵巢癌组织中LIMD2蛋白呈阳性。然后,我们通过蛋白质印迹实验与RT-PCR实验发现,五种人类卵巢癌细胞株(A2780、HO8910PM、SKOV-3、HO8910、OVCAR-3)均表达LIMD2蛋白分子与LIMD2 m RNA,并且各细胞株中LIMD2蛋白与LIMD2 m RNA含量不同。利用免疫荧光与细胞免疫组化技术,我们发现LIMD2大部分表达在细胞质中,少部分表达在细胞膜上。接下来,本课题组对LIMD2的功能及机制进行探索。首先,我们将卵巢癌细胞株中的LIMD2基因进行干扰与过表达,利用CCK-8实验、Transwell迁移实验及细胞划痕实验等进行体外生物学功能研究。结果显示,相对于对照组卵巢癌细胞株,LIMD2沉默的细胞株增殖与迁移能力降低;而LIMD2过表达的卵巢癌细胞株增殖与迁移能力增强。同时,卵巢癌裸鼠模型实验结果显示,LIMD2沉默的卵巢癌细胞皮下成瘤能力下降,生长速度较慢;同时在腹腔内转移能力也下降,生长出的肿瘤数量较少并且质量较小。相应地,过表达LIMD2的卵巢癌细胞株皮下成瘤能力增强,增殖速度较快;在裸鼠腹腔内更容易转移与生长,裸鼠腹腔内往往形成大量腹水,生长出的肿瘤数量较多并且质量较大。这些研究表明,LIMD2基因沉默能有效抑制卵巢癌细胞在裸鼠体内的增殖与迁移,LIMD2基因过表达能有效促进卵巢癌细胞在裸鼠体内的增殖与迁移。为了进一步研究LIMD2促进卵巢癌恶化的作用机制,我们将LIMD2沉默的细胞株与对照组细胞株进行转录组测序。分析结果表明,Focal adhesion通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞外基质-受体相互反应通路与细胞凋亡等都受到了LIMD2沉默的影响。结合前面蛋白组学的结果,Focal adhesion通路、MAPK信号通路等均在卵巢癌恶化的进程中发挥作用。这从侧面证明,LIMD2基因可能与卵巢癌的恶化相关。我们随后研究LIMD2蛋白与Focal adhesion通路的关系。Western-blot检测结果表明,与对照组卵巢癌细胞株相比,LIMD2沉默的细胞株FAK、P-FAK、RAC1、Tensin2等表达均明显降低。利用FAK抑制剂Y15处理天然卵巢癌细胞株,FAK、P-FAK、RAC1等表达也受到了抑制。相应地,过表达LIMD2的卵巢癌细胞中,LIMD2、FAK、RAC1、Tensin2、ɑ-Actinin、Vinculin等蛋白的表达量增加,而且,除了Focal adhesion信号通路相关蛋白外,MMP9与MMP2等与肿瘤转移相关的蛋白的表达量也增加。这说明LIMD2可能通过Focal adhesion信号通路影响卵巢癌细胞的恶化进程。随后,我们利用免疫共沉淀,对附带有FLAG标签且过表达LIMD2的卵巢癌细胞株进行研究。结果显示,LIMD2与CISD2有着直接相互作用,并且两者之间有着一定的结合力。通过生物信息学分析发现,CISD2与LIMD2的表达存在正相关性,且CISD2在卵巢癌组织中过表达,与较差的预后相关。Western blot检测结果表明,过表达LIMD2时,CISD2与FAK均表达升高。而在过表达LIMD2的细胞株中利用RNA干扰技术使CISD2基因沉默时,FAK的表达也得到了抑制。研究说明,LIMD2的过表达促进CISD2的高表达,进而促进FAK蛋白表达量的升高。当抑制CISD2基因表达时,FAK基因也受到了抑制。结果表明,LIMD2能够促进FAK基因的表达,但是CISD2的沉默能够抑制这个过程。为了研究LIMD2在临床检验中的应用潜力,本课题组进一步制备了LIMD2的单克隆抗体与多克隆抗体。首先,我们将经过优化的编码LIMD2的DNA序列克隆进PSMART载体质粒中,然后将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3),利用0.1m M的IPTG诱导大肠杆菌表达LIMD2蛋白。经过STarm Streptactin Beads与镍柱两次纯化,我们得到纯度超过90%的LIMD2蛋白。接着,我们用经过纯化的LIMD2蛋白分别免疫小鼠与家兔,分别得到5种LIMD2的单克隆抗体(4F3B12、3E5C7、3F4B3、3F4C1与4F5F12)与1种多克隆抗体。Western blot实验结果显示,这5种单克隆抗体与多克隆抗体均能与原核表达的重组LIMD2蛋白结合,也能与卵巢癌细胞株中的天然LIMD2蛋白特异性结合。另外,我们对5种单克隆抗体进行了亚型鉴定。结果显示,4F3B12与3E5C7属于Ig G2a Kappa亚型,3F4B3与3F4C1属于Ig G2b Kappa亚型,4F5F12属于Ig G1 Kappa亚型。针对抗原LIMD2的ELISA实验结果表明,我们制备的多克隆抗体效价高于128K,单克隆抗体4F3B12、3E5C7和3F4B3效价达到512 K以上,单克隆抗体3F4C1和4F5F12效价达到256 K以上。我们通过交叉反应检测5种单克隆抗体与LIMD2近似蛋白LIMD1与LIMS1的结合能力。ELISA检测结果表明,3F4B3抗体针对LIMD1-His效价在16K左右,针对LIMS1-GST效价在2K左右;3F4C1抗体针对LIMD1-His效价在9K左右,针对LIMS1-GST效价在2K左右;3E5C7抗体针对LIMD1-His效价在0.6K左右,针对LIMS1-GST无效价;4F3B12抗体针对LIMD1-His效价在0.8K左右,针对LIMS1-GST效价在0.4K左右;4F5F12抗体针对LIMD1-His无效价,针对LIMS1-GST无效价。同时,Western blot实验结果显示,4F3B12、3E5C7、3F4B3、3F4C1与4F5F12均能与LIMD2蛋白结合,不能与LIMD2近似蛋白LIMS1结合,其中,4F3B12、3E5C7、3F4B3、4F5F12均不与LIMD1结合,仅3F4C1能与LIMD1结合。最后,我们利用5种单克隆抗体和1种多克隆抗体与大肠杆菌表达的LIMD2蛋白及卵巢癌细胞表达的LIMD2蛋白进行蛋白印迹实验,发现这5种单克隆抗体和1种多克隆抗体既能与原核表达的重组LIMD2蛋白结合,也能与卵巢癌细胞表达的LIMD2蛋白结合。随后,我们利用单抗4F5F12和LIMD2多抗对卵巢癌手术标本进行免疫组化,结果显示LIMD2在正常组织中不表达,在卵巢癌组织中高表达。这一系列研究为LIMD2的临床检验应用打下了良好的基础。综上所述,我们找到一个有潜力的卵巢癌生物标志物LIMD2蛋白。LIMD2通过Focal Adhesion信号通路促进卵巢癌细胞的增殖与转移。LIMD2也能促进CISD2的表达,进而促进FAK的表达。而LIMD2促进FAK表达的过程,能够被CISD2基因的沉默所抑制。制备的LIMD2单克隆抗体与多克隆抗体均能与LIMD2的原核表达产物及真核蛋白结合,为LIMD2的临床检测应用打下基础。