论文部分内容阅读
石细胞是梨（Pyrus）果实特有的一类细胞,其导致果肉粗糙、汁液少等问题,是影响梨果实食用口感和加工品质的重要因素之一,特别是我国栽培量大的特色传统品种‘砀山酥梨’,由于近年来管理不善及遗传特性的原因,石细胞发生尤为严重。石细胞是由薄壁细胞通过程序性细胞死亡（Program cell death,PCD）和纤维素、木质素沉积使次生细胞壁（Secondery cell wall,SCW）增厚而形成。类半胱氨酸蛋白酶（Metacaspase,MC）是一种参与PCD调节、细胞周期、衰老以及氧化应激反应的多功能蛋白质。本文首先对中国白梨（Pyrus bretschneideri）基因组中MC家族进行生物信息学分析,通过蛋白序列比对和共线性分析,结合生理指标、组织定量PCR和实时荧光定量PCR分析筛选出关键基因PbMC1a/1b。然后将PbMC1a/1b稳定转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）和瞬时侵染梨叶片,验证与木质素和石细胞形成的关系,通过酵母双杂和双分子荧光互补实验,筛选出互作蛋白PbRD21。最后对蔷薇科NAC基因家族进行生物信息学分析,结合果实发育转录组数据筛选出与木质素合成和调控PCD相关基因,并对PbMC1a/1b和PbRD21启动子序列分析,筛选出可能调控PbMC1a/1b和PbRD21的PbNAC基因。研究主要得到的结果如下:1.对梨基因组序列分析与筛选,共鉴定到11个PbMC基因,其中8个PbMC基因定位在5条染色体上,3个基因定位在支架重叠群上。根据基因结构、蛋白质基序和系统进化发育拓扑结构,将梨PbMC家族分为2个亚家族,每个亚家族内的PbMC基因具有相似的外显子/内含子结构和保守基序,梨和拟南芥MC蛋白结构中含有MC家族特有的P10和P20亚基。全基因组/节段复制在PbMC家族扩展中发挥了关键作用,纯化选择是推动PbMC家族基因进化的主要力量。果实发育中木质素和石细胞含量测定,组织定量PCR和qRT-PCR分析PbMC基因在梨果实发育中的表达模式,发现PbMC1a/1b在果实发育早期具有高表达量,并且与石细胞和木质素含量变化趋势一致。2.通过PCR扩增PbMC1a/1b的全长ORF,构建到pCAMBIA1300和p-TRV2载体上。瞬时侵染烟草叶片细胞显示PbMC1a/1b蛋白定位于细胞质和细胞核中。融合表达载体p35S-PbMC1a/1b-GFP农杆菌稳定转化拟南芥后,转基因系茎中导管、木质纤维和维管束间纤维细胞壁显著增厚,促进了茎中木质素的积累并抑制了植株的生长,提高了木质素生物合成相关基因的表达量。酵母双杂和X-α-Gal染色显示PbMC1a/1b和PbRD21蛋白之间存在互作,双分子荧光互补实验显示PbMC1a/1b和PbRD21的互作位置在细胞质和细胞核中。同时,PbMC1a/1b和PbRD21的瞬时表达导致梨叶片中木质素含量和木质素合成相关基因表达量的显著变化。结果充分表明梨PbMC1a/1b在细胞壁木质化和木质素沉积中起重要作用,并可能通过与PbRD21相互作用来提高木质素合成相关基因的mRNA水平。3.对蔷薇科苹果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）、梅（Prunus mume）、森林草莓（Fragaria vesca）和梨（Pyrus bretschneideri）基因组序列分析与筛选,分别鉴定到171、114、113、127和183个NAC基因。根据基因结构、蛋白质基序和系统发育树拓扑结构分析,将NAC家族分为33个亚家族。通过比较和分析蔷薇科中独特的NAC亚家族,共确定了梨中特有的19个NAC亚家族。其中146个PbNAC基因定位在16条染色体上,37个PbNAC基因位于支架重叠群上。全基因组/节段复制在梨的NAC家族扩展中发挥了关键作用,83对PbNAC重复基因对可以追溯到两次全基因组复制事件,纯化选择是推动PbNAC家族基因进化的主要力量。果实发育转录组数据并结合同源基因分析显示4个PbNAC基因参与苯丙烷类生物合成和调控PCD。对PbMC1a/1b和PbRD21启动子序列分析显示这两个基因存在NAC特异性识别基序,表明4个PbNAC基因具有调控这两个基因的潜能。