朊病毒病(Priondisease)是一组累及人和动物的传染性神经退行性疾病。其致病因子是一种无核酸的传染性蛋白颗粒。 本课题组前期工作发现，朊蛋白糖基化比率与细胞生物学功能之间存在一定的联系。本研究通过对PrP进行糖基化修饰，来研究其对细胞生物学功能的影响。首先从健康人外周血白细胞总DNA中克隆得到人朊蛋白基因PRNP，并通过定点突变的方法获得两种糖基化单位点突变的PRNPN181Q、PRNPN197Q(分别突变第一个和第二个糖基化位点)和一种去N-糖基化突变的PRNPN181Q/N197Q朊蛋白基因(同时突变两个糖基化位点)。将上述质粒导入SF126和HeLa细胞等哺乳动物细胞表达系统，Westernblot检测证实，表达的野生型PrP蛋白呈现多糖基化修饰带型，分子量范围30-35kDa。经糖苷酶PNGaseF消化后，电泳条带下移。两种N-糖基化单点修饰PrP表达不完全的糖基化形式，分子量在29-30kDa;而去N-糖基化修饰PrP不具有N-糖基化的形式，分子量约27kDa。糖基化修饰的PrP均能够被糖苷酶消化，分子条带下移。表明成功表达野生型PrP和所设计的单糖基化和去N-糖基化修饰。 利用Hoechst33342/PI细胞核染色、MTT法分析细胞增殖、AnnexinV/PI双染检测PS外翻和PI单染检测细胞凋亡率等经典细胞凋亡检测方法，证明在体外实验条件下，在SF126和HeLa细胞中表达重组朊蛋白，与野生型PrP比较，去N-糖基化修饰PrP易于引发更为明显的凋亡现象，N-糖基化单点修饰PrP的致凋亡作用较轻微，与野生型接近。进一步证明发生细胞凋亡的机制，分析了细胞内活性氧，发现与野生型PrP比较，去N-糖基化修饰PrP更容易引发HeLa细胞中活性氧的堆积，在转染12h达到高峰，说明ROS在细胞早期凋亡中发挥着重要的作用。线粒体与活性氧有着密切的关系，进一步分析了线粒体的变化。N-糖基化PrP引发的细胞线粒体膜电位明显下降。Westernblot分析线粒体相关蛋白发现，凋亡细胞Bcl-xL蛋白表达水平明显下调，而Bax表达水平未见明显改变，还检测到大量活化的Caspase-9蛋白。提示糖基化修饰蛋白引发的凋亡可能与活性氧的产生，线粒体信号转导途径及相关凋亡蛋白Bcl-xL下调，Bax蛋白和下游的Caspase-9蛋白的活化相关。