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背景
甲型流感病毒是一种具有高度传染性和致病性的病毒，且具有高突变性，流感易苗易于失效且抗病毒药物治疗具有一定局限性。因此，以宿主因素为靶点的治疗手段成为抗流感病毒新兴疗法和未来趋势，而这一转变正是中医邪正关系的体现，也正是中医治疗的优势所在。
细胞自噬是流感病毒与宿主之间相互作用的重要机制之一。甲型流感病毒可以诱导自噬体的大量堆积并阻止自噬体与溶酶体的融合，从而导致自噬流的不顺畅。而自噬流的不顺畅恰好与伤寒少阳枢机不利非常相似。因此，基于这个层面，针对少阳枢机不利，选用少阳方(如小柴胡汤)，将可能促进有效自噬流的完成，从而截断病情的深入，防止肺炎的发生。
小柴胡汤是《伤寒论》少阳病的主方，也是扶正祛邪的代表方，已有研究报道，小柴胡汤具有明显的抗流感病毒作用，同时能提高机体免疫力和降低炎性反应。而对于小柴胡汤调节自噬的作用却鲜为报道。因此，本研究从科学计量学、理论研究、网络药理学和实验研究四个方面对小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的疗效、作用机制及配伍意义进行初步探讨，以期为防治病毒感染性疾病用药靶点提供新的思路。
目的
1.运用科学计量学方法(citespace)对流感研究现状及前沿热点进行分析并挖掘流感与自噬共同作用通路，预测未来研究趋势。
2.通过溯源少阳本义，结合《伤寒论》原文，从少阳病病机演变、小柴胡汤方证、小柴胡汤中药药理学谱等方面阐述小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的理论及临床依据。
3．对小柴胡汤治疗流行性感冒的网络药理学研究，从“中药-成分-靶点-通路”的层面预测其主要作用机制，及体现药物配伍意义的主要通路。
4．结合组方原则及网药结果，研究小柴胡汤及拆方对H1N1流感病毒的体外抑制作用，其机制是否与自噬相关，并阐释其配伍意义。
方法
1．以“流行性感冒”为研究主题，运用citespace软件，检索WebofScience(WoS)数据库的2005-2020年文献，将结果从关键词共现、关键词聚类、关键词突现、双图叠加等四个方面进行可视化分析。
2.筛选小柴胡汤有效成分并对应靶点基因，并检索流感疾病靶点。应用Cytoscape3.2.6软件构建小柴胡汤-流感-靶点-通路网络，筛选核心靶点基因，进行GO功能和KEGG富集分析，预测主要作用机制及复方配伍意义主要通路。
3．制备小柴胡汤及拆方的水提醇沉提取液、颗粒剂及含药血清三种制剂，分别对人A549、狗肾细胞(MDCK)两种细胞系进行细胞毒性测定和神经氨酸酶活性测定，筛选最优制备方案和最适细胞系。
4．基于最适细胞系和小柴胡汤及拆方最适制备方案，运用免疫印迹法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、mTOR及磷酸化、beclin蛋白表达表达，探讨小柴胡汤及拆方对流感病毒诱导自噬的调控及作用机制，并阐释并配伍意义。
结果
1.共纳入流感机制文献7223篇，关键词聚类主要分为流感致病性和发病机制研究；宿主免疫应答及炎性反应研究；抗流感药物及疫苗的研究。流行性感冒机制研究与细胞自噬研究领域共同的关键词为自噬、复制、感染、凋亡、NF-κB、天然免疫反应等。
2.小柴胡汤成分靶点与流感疾病靶点共有51个靶点，其主要成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素、β-谷甾醇、二甲氧基黄酮、人参皂苷Rh2、蓝堇碱、叶含长管贝壳杉素A九种，其核心基因为VEGFA、AKT1、IL6、TNF、MMP9、JUN、IL10、IL18等十个，其富集分析多与炎症反应、各种代谢相关。
3.在MDCK细胞中，小柴胡汤及核心拆方水提液的抗病毒选择指数均为1左右；小鼠血清在体外(细胞)抗病毒实验中表现出极强的抗流感病毒活性，选择指数为128.2以上；小柴胡汤、柴-芩-参颗粒剂的抗病毒选择指数均为1左右，柴-芩颗粒剂的抗病毒选择指数为2，具有一定的抗病毒效力。此外，小柴胡汤及拆方颗粒剂对人A549细胞的存活率整体不高，尤其是柴-芩颗粒剂低浓度对A549细胞即显示一定毒性，存活率＜85%。在神经氨酸酶抑制活性检测中显示，小柴胡汤及拆方颗粒剂对H1N1流感病毒没有抑制作用，无SI。
4.病毒感染组与空白对照组相比，LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)。小柴胡汤及拆方颗粒剂与病毒感染对照组相比，有下调LC3-Ⅱ蛋白表达的作用(P＜0.01)，尤以小柴胡汤组最为明显。与病毒感染组相比，小柴胡汤及拆方颗粒剂均有上调p62蛋白表达的作用，其中，柴-芩组最为明显(P＜0.01)，柴-芩-参组次之(P＜0.05)，小柴胡汤最次。小柴胡汤及拆方三组与病毒感染组相比，有上调p-mTOR蛋白水平表达的趋势(P＞0.05)，其中柴-芩组上调作用最为明显。小柴胡汤组与病毒感染组相比，下调beclin-1蛋白表达最为明显(P＜0.05)，柴-芩-参组下调作用最次，无统计学差异(P＞0.05)。
结论
1.科学计量学及理论研究表明，流感的发生发展以及严重程度与病毒和宿主的相互关系密不可分。以宿主为靶点的治疗手段是该领域研究的重要转变，而这一转变正体现了中医扶正祛邪的治疗特色。细胞自噬是流感病毒与宿主之间相互作用的重要机制之一。在中医看来，甲流病毒导致自噬流的不顺畅与伤寒少阳枢机不利非常相似，这也正与小柴胡汤方证相合。
2.网络药理学结果可知，小柴胡汤可调节神经-免疫-炎症反应，治疗甲型流行性感冒，其主要机制与柴胡、黄芩、人参三味药相关。
3.实验结果可知，从抑制甲型H1N1神经氨酸酶活性而言，仅柴胡-黄芩表现出一定抑制作用，体现了其祛邪之功。小柴胡汤无抑制NA活性作用，但在自噬调节上作用明显，且在下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达及抑制Beclin-1蛋白水平方面更为突出，其机制可能与Beclin-1相关，而同样具有扶正祛邪之意的柴胡-黄芩-人参组却有差异，提示夏、姜、枣、草四味药可能在配伍中发挥着促进自噬降解的作用。此外，鉴于小柴胡汤本身不能抑制NA活性，说明小柴胡汤的作用靶点可能不直接作用于病毒，可能主要在宿主因素，与调节自噬、促进自噬代谢途径有关。因此，小柴胡汤对自噬的调节作用，从某种意义上讲，拓展了小柴胡汤临床运用的新思路，也在一定程度上揭示了小柴胡汤扶正祛邪的作用机制与药物君臣佐使配伍的意义，为今后进一步深入研究奠定基础。
甲型流感病毒是一种具有高度传染性和致病性的病毒，且具有高突变性，流感易苗易于失效且抗病毒药物治疗具有一定局限性。因此，以宿主因素为靶点的治疗手段成为抗流感病毒新兴疗法和未来趋势，而这一转变正是中医邪正关系的体现，也正是中医治疗的优势所在。
细胞自噬是流感病毒与宿主之间相互作用的重要机制之一。甲型流感病毒可以诱导自噬体的大量堆积并阻止自噬体与溶酶体的融合，从而导致自噬流的不顺畅。而自噬流的不顺畅恰好与伤寒少阳枢机不利非常相似。因此，基于这个层面，针对少阳枢机不利，选用少阳方(如小柴胡汤)，将可能促进有效自噬流的完成，从而截断病情的深入，防止肺炎的发生。
小柴胡汤是《伤寒论》少阳病的主方，也是扶正祛邪的代表方，已有研究报道，小柴胡汤具有明显的抗流感病毒作用，同时能提高机体免疫力和降低炎性反应。而对于小柴胡汤调节自噬的作用却鲜为报道。因此，本研究从科学计量学、理论研究、网络药理学和实验研究四个方面对小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的疗效、作用机制及配伍意义进行初步探讨，以期为防治病毒感染性疾病用药靶点提供新的思路。
目的
1.运用科学计量学方法(citespace)对流感研究现状及前沿热点进行分析并挖掘流感与自噬共同作用通路，预测未来研究趋势。
2.通过溯源少阳本义，结合《伤寒论》原文，从少阳病病机演变、小柴胡汤方证、小柴胡汤中药药理学谱等方面阐述小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的理论及临床依据。
3．对小柴胡汤治疗流行性感冒的网络药理学研究，从“中药-成分-靶点-通路”的层面预测其主要作用机制，及体现药物配伍意义的主要通路。
4．结合组方原则及网药结果，研究小柴胡汤及拆方对H1N1流感病毒的体外抑制作用，其机制是否与自噬相关，并阐释其配伍意义。
方法
1．以“流行性感冒”为研究主题，运用citespace软件，检索WebofScience(WoS)数据库的2005-2020年文献，将结果从关键词共现、关键词聚类、关键词突现、双图叠加等四个方面进行可视化分析。
2.筛选小柴胡汤有效成分并对应靶点基因，并检索流感疾病靶点。应用Cytoscape3.2.6软件构建小柴胡汤-流感-靶点-通路网络，筛选核心靶点基因，进行GO功能和KEGG富集分析，预测主要作用机制及复方配伍意义主要通路。
3．制备小柴胡汤及拆方的水提醇沉提取液、颗粒剂及含药血清三种制剂，分别对人A549、狗肾细胞(MDCK)两种细胞系进行细胞毒性测定和神经氨酸酶活性测定，筛选最优制备方案和最适细胞系。
4．基于最适细胞系和小柴胡汤及拆方最适制备方案，运用免疫印迹法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、mTOR及磷酸化、beclin蛋白表达表达，探讨小柴胡汤及拆方对流感病毒诱导自噬的调控及作用机制，并阐释并配伍意义。
结果
1.共纳入流感机制文献7223篇，关键词聚类主要分为流感致病性和发病机制研究；宿主免疫应答及炎性反应研究；抗流感药物及疫苗的研究。流行性感冒机制研究与细胞自噬研究领域共同的关键词为自噬、复制、感染、凋亡、NF-κB、天然免疫反应等。
2.小柴胡汤成分靶点与流感疾病靶点共有51个靶点，其主要成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素、β-谷甾醇、二甲氧基黄酮、人参皂苷Rh2、蓝堇碱、叶含长管贝壳杉素A九种，其核心基因为VEGFA、AKT1、IL6、TNF、MMP9、JUN、IL10、IL18等十个，其富集分析多与炎症反应、各种代谢相关。
3.在MDCK细胞中，小柴胡汤及核心拆方水提液的抗病毒选择指数均为1左右；小鼠血清在体外(细胞)抗病毒实验中表现出极强的抗流感病毒活性，选择指数为128.2以上；小柴胡汤、柴-芩-参颗粒剂的抗病毒选择指数均为1左右，柴-芩颗粒剂的抗病毒选择指数为2，具有一定的抗病毒效力。此外，小柴胡汤及拆方颗粒剂对人A549细胞的存活率整体不高，尤其是柴-芩颗粒剂低浓度对A549细胞即显示一定毒性，存活率＜85%。在神经氨酸酶抑制活性检测中显示，小柴胡汤及拆方颗粒剂对H1N1流感病毒没有抑制作用，无SI。
4.病毒感染组与空白对照组相比，LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)。小柴胡汤及拆方颗粒剂与病毒感染对照组相比，有下调LC3-Ⅱ蛋白表达的作用(P＜0.01)，尤以小柴胡汤组最为明显。与病毒感染组相比，小柴胡汤及拆方颗粒剂均有上调p62蛋白表达的作用，其中，柴-芩组最为明显(P＜0.01)，柴-芩-参组次之(P＜0.05)，小柴胡汤最次。小柴胡汤及拆方三组与病毒感染组相比，有上调p-mTOR蛋白水平表达的趋势(P＞0.05)，其中柴-芩组上调作用最为明显。小柴胡汤组与病毒感染组相比，下调beclin-1蛋白表达最为明显(P＜0.05)，柴-芩-参组下调作用最次，无统计学差异(P＞0.05)。
结论
1.科学计量学及理论研究表明，流感的发生发展以及严重程度与病毒和宿主的相互关系密不可分。以宿主为靶点的治疗手段是该领域研究的重要转变，而这一转变正体现了中医扶正祛邪的治疗特色。细胞自噬是流感病毒与宿主之间相互作用的重要机制之一。在中医看来，甲流病毒导致自噬流的不顺畅与伤寒少阳枢机不利非常相似，这也正与小柴胡汤方证相合。
2.网络药理学结果可知，小柴胡汤可调节神经-免疫-炎症反应，治疗甲型流行性感冒，其主要机制与柴胡、黄芩、人参三味药相关。
3.实验结果可知，从抑制甲型H1N1神经氨酸酶活性而言，仅柴胡-黄芩表现出一定抑制作用，体现了其祛邪之功。小柴胡汤无抑制NA活性作用，但在自噬调节上作用明显，且在下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达及抑制Beclin-1蛋白水平方面更为突出，其机制可能与Beclin-1相关，而同样具有扶正祛邪之意的柴胡-黄芩-人参组却有差异，提示夏、姜、枣、草四味药可能在配伍中发挥着促进自噬降解的作用。此外，鉴于小柴胡汤本身不能抑制NA活性，说明小柴胡汤的作用靶点可能不直接作用于病毒，可能主要在宿主因素，与调节自噬、促进自噬代谢途径有关。因此，小柴胡汤对自噬的调节作用，从某种意义上讲，拓展了小柴胡汤临床运用的新思路，也在一定程度上揭示了小柴胡汤扶正祛邪的作用机制与药物君臣佐使配伍的意义，为今后进一步深入研究奠定基础。