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目的：
中药陵水暗罗提取物暗罗素（Zinc Pyrithione，ZPT）为含锌离子化合物，研究者前期研究已证实ZPT联合锌离子具有抑制卵巢癌细胞增殖活性，增加顺铂耐药的卵巢癌细胞株的凋亡。本研究将探讨ZPT联合锌离子对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响。通过多种分子生物化学方法，明确ZPT联合锌离子对肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡、克隆形成、NFκB活性、锌离子分布和溶酶体渗透性的影响。本研究将为ZPT联合锌离子抑制肾透明细胞癌细胞活性提供科学依据和理论基础。
方法：
1.细胞培养:提前将RPMI加入胎牛血清中制备成浓度为10%的培养液,用以上培养基培育肾透明细胞癌786-O和769-P细胞株，恒温箱内孵育24h，待对数生长期备用。
2.Methods for Testing and Specifications（MTS）法检测ZPT联合ZnCl2对786-O和769-P的增殖抑制效应，并计算两株细胞ZPT的IC50,同时检测ZPT联合ZnCl2对两株肾透明细胞癌细胞增殖抑制的浓度效应和时间效应；实验每次设3个平行样本，实验多次重复以确定结果稳定性。在确定ZPT最佳使用浓度后，采用MTS法检测最佳浓度ZPT联合ZnCl2处理两株肾透明细胞癌细胞0h,12h,24h,48h和72h，观察增殖能力随时间变化趋势。
3.克隆形成实验检测ZPT联合ZnCl2对两株细胞克隆形成的影响：实验分3组，DMSO对照组、ZnCl2组和ZPT+ZnCl2联合组,将786-O和769-P细胞接种到三组的六孔板中培养、洗涤、染色、再洗涤、显微镜下观察，再按公式计算克隆形成率。
4.实验分组同上，用流式细胞仪检测对照组、ZnCl2组和ZPT+ZnCl2联合组分别对两株细胞凋亡的影响。
5.NF-kB-LUC荧光素酶法检测ZPT联合锌离子对两株细胞NFκB转录活性的影响。
6.锌离子示踪剂Zinc-tracker探针跟踪细胞内锌离子分布，Lysosome tracker探针示踪溶酶体在细胞内分布；采用Molecular Probes公司的三种探针FluoZin-3和LysoTracker分别结合786-O细胞内锌离子和溶酶体，在特定激发光作用下，用荧光显微镜记录它们的分布，分析锌离子的细胞内外分布。采用通用型锌(Zn)含量荧光(FluoZin-3)定量检测试剂盒检测ZPT对锌离子在786-O细胞内外的分布影响。
7.用吖啶橙（AO）荧光染色检测肾透明细胞癌细胞内溶酶体渗透性变化。
8.统计学分析：以上实验数据均采用Graphpad Prizm8.0统计软件处理分析。计量资料以均数±标准差(SD)记录。实验组间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.ZPT+ZnCl2组较其他实验组可显著抑制肾透明细胞癌细胞株的增殖活性，其活性效应呈剂量依赖性和时间依赖性，联合使用ZnCl250μM处理观察72h后，IC50值分别为501.8nM和694.7nM。固定ZnCl2浓度为50μM，随着ZPT药物浓度增加，肾透明细胞癌细胞的成活率逐渐下降，ZPT剂量为3200nM时，786-O和769-P细胞存活率分别为20.23%和24.75%。500nM和700nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O和769-P细胞随处理时间增加细胞增殖抑制效应增强，处理时间为72h后786-O和769-P细胞存活率分别为43.55%和38.16%。
2.克隆形成实验显示500nM和700nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O和769-P细胞10天后，两株细胞的克隆形成率分别为对照组的40.24%和45.24%。
3.流式细胞仪检测细胞凋亡水平显示：500nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O细胞12h后凋亡明显增加（DMSO vs ZPT+ ZnCl2组：1.67% vs36.04%）。
4.FKB-LUC荧光素酶法检测显示：500nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O细胞6h后，可以显著抑制其NFκB转录活性（Control vs500nM ZPT vs50μM ZnCl2 vs ZPT+ ZnCl2: P＜0.01）。
5.锌离子示踪显示ZPT联合锌离子组的细胞胞浆内锌离子信号明显增高，双探针同时染色细胞内锌离子和溶酶体显示，ZPT联合锌离子组的锌离子和溶酶体在细胞内高度共定位。
6.AO染色显示：相对于对照组、ZPT组和锌离子组，ZPT联合锌离子组的溶酶体膜渗透性明显增加。
结论：
1.中药提取物ZPT本身含有锌离子，可以抑制786-O和769-P细胞增殖；联合锌离子抑制效果更强，并且呈剂量和时间依赖性；同时还抑制786-O和769-P的克隆形成率，增加肾透明细胞癌细胞的凋亡。
2.ZPT联合锌离子可以抑制肾透明细胞癌细胞的增殖，抑制肾透明细胞癌细胞NFκB活性和增加溶酶体膜渗透性是其可能机制。
中药陵水暗罗提取物暗罗素（Zinc Pyrithione，ZPT）为含锌离子化合物，研究者前期研究已证实ZPT联合锌离子具有抑制卵巢癌细胞增殖活性，增加顺铂耐药的卵巢癌细胞株的凋亡。本研究将探讨ZPT联合锌离子对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响。通过多种分子生物化学方法，明确ZPT联合锌离子对肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡、克隆形成、NFκB活性、锌离子分布和溶酶体渗透性的影响。本研究将为ZPT联合锌离子抑制肾透明细胞癌细胞活性提供科学依据和理论基础。
方法：
1.细胞培养:提前将RPMI加入胎牛血清中制备成浓度为10%的培养液,用以上培养基培育肾透明细胞癌786-O和769-P细胞株，恒温箱内孵育24h，待对数生长期备用。
2.Methods for Testing and Specifications（MTS）法检测ZPT联合ZnCl2对786-O和769-P的增殖抑制效应，并计算两株细胞ZPT的IC50,同时检测ZPT联合ZnCl2对两株肾透明细胞癌细胞增殖抑制的浓度效应和时间效应；实验每次设3个平行样本，实验多次重复以确定结果稳定性。在确定ZPT最佳使用浓度后，采用MTS法检测最佳浓度ZPT联合ZnCl2处理两株肾透明细胞癌细胞0h,12h,24h,48h和72h，观察增殖能力随时间变化趋势。
3.克隆形成实验检测ZPT联合ZnCl2对两株细胞克隆形成的影响：实验分3组，DMSO对照组、ZnCl2组和ZPT+ZnCl2联合组,将786-O和769-P细胞接种到三组的六孔板中培养、洗涤、染色、再洗涤、显微镜下观察，再按公式计算克隆形成率。
4.实验分组同上，用流式细胞仪检测对照组、ZnCl2组和ZPT+ZnCl2联合组分别对两株细胞凋亡的影响。
5.NF-kB-LUC荧光素酶法检测ZPT联合锌离子对两株细胞NFκB转录活性的影响。
6.锌离子示踪剂Zinc-tracker探针跟踪细胞内锌离子分布，Lysosome tracker探针示踪溶酶体在细胞内分布；采用Molecular Probes公司的三种探针FluoZin-3和LysoTracker分别结合786-O细胞内锌离子和溶酶体，在特定激发光作用下，用荧光显微镜记录它们的分布，分析锌离子的细胞内外分布。采用通用型锌(Zn)含量荧光(FluoZin-3)定量检测试剂盒检测ZPT对锌离子在786-O细胞内外的分布影响。
7.用吖啶橙（AO）荧光染色检测肾透明细胞癌细胞内溶酶体渗透性变化。
8.统计学分析：以上实验数据均采用Graphpad Prizm8.0统计软件处理分析。计量资料以均数±标准差(SD)记录。实验组间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.ZPT+ZnCl2组较其他实验组可显著抑制肾透明细胞癌细胞株的增殖活性，其活性效应呈剂量依赖性和时间依赖性，联合使用ZnCl250μM处理观察72h后，IC50值分别为501.8nM和694.7nM。固定ZnCl2浓度为50μM，随着ZPT药物浓度增加，肾透明细胞癌细胞的成活率逐渐下降，ZPT剂量为3200nM时，786-O和769-P细胞存活率分别为20.23%和24.75%。500nM和700nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O和769-P细胞随处理时间增加细胞增殖抑制效应增强，处理时间为72h后786-O和769-P细胞存活率分别为43.55%和38.16%。
2.克隆形成实验显示500nM和700nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O和769-P细胞10天后，两株细胞的克隆形成率分别为对照组的40.24%和45.24%。
3.流式细胞仪检测细胞凋亡水平显示：500nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O细胞12h后凋亡明显增加（DMSO vs ZPT+ ZnCl2组：1.67% vs36.04%）。
4.FKB-LUC荧光素酶法检测显示：500nM ZPT联合50μM ZnCl2处理786-O细胞6h后，可以显著抑制其NFκB转录活性（Control vs500nM ZPT vs50μM ZnCl2 vs ZPT+ ZnCl2: P＜0.01）。
5.锌离子示踪显示ZPT联合锌离子组的细胞胞浆内锌离子信号明显增高，双探针同时染色细胞内锌离子和溶酶体显示，ZPT联合锌离子组的锌离子和溶酶体在细胞内高度共定位。
6.AO染色显示：相对于对照组、ZPT组和锌离子组，ZPT联合锌离子组的溶酶体膜渗透性明显增加。
结论：
1.中药提取物ZPT本身含有锌离子，可以抑制786-O和769-P细胞增殖；联合锌离子抑制效果更强，并且呈剂量和时间依赖性；同时还抑制786-O和769-P的克隆形成率，增加肾透明细胞癌细胞的凋亡。
2.ZPT联合锌离子可以抑制肾透明细胞癌细胞的增殖，抑制肾透明细胞癌细胞NFκB活性和增加溶酶体膜渗透性是其可能机制。