舌鳞状细胞癌的circRNAs表达谱及circARNTL2生物学功能研究

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背景与目的:高通量测序的飞速发展使得越来越多的环状RNAs(circular RNAs,circ RNAs)被研究发现。文献报道circ RNAs在多种人类肿瘤中发挥着重要的作用。然而,circ RNAs在舌鳞状细胞癌(Tongue Squamous Cell Carcinoma,TSCC)方面的研究甚少。本课题研究致力于探索TSCC中circ RNAs的表达谱及circ ARNTL2对TSCC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期等生物学行为的影响。材料与方法:本研究通过高通量测序和生物信息学技术分析6对TSCC癌组织和癌旁组织差异表达的circ RNAs。选择收录于circ Base数据库,在癌组织中表达上调且表达差异大的4条基因,通过RT-q PCR在20对TSCC患者标本中进行验证。随后,采用RT-q PCR在TSCC细胞系中检测circ ARNTL2的表达情况。通过Random 6 mers primers和Oligo d T primers逆转录实验、RNase R实验和Sanger测序检验circ ARNTL2成环特性。RNA核质分离实验检测circ ARNTL2在细胞质和细胞核中的表达情况。卡方检验统计分析circ ARNTL2的表达量与TSCC患者临床病理因素的相关性。受试者工作曲线(receiver operating curve,ROC)评估circ ARNTL2作为TSCC生物标志物的诊断价值。si RNA瞬时转染CAL27和SCC9细胞,并选择敲降效果最为明显的si RNA进行体外功能实验。干扰circ ARNTL2后,CCK8实验检测细胞增殖能力;平板克隆实验检测克隆形成能力;活死细胞染色检测细胞活力;划痕实验和Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡和周期。蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验检测相关蛋白表达情况。结果:高通量测序结果显示差异表达的circ RNAs共有276个(差异倍数≥2,p<0.05),其中上调的有68个,下调的有208个。RT-q PCR结果显示相较于癌旁组织,circ ARNTL2在TSCC癌组织中表达量上调最为明显(p=0.0009)且在CAL27和SCC9细胞中表达上调(p<0.05)。Random 6 mers primers和Oligo d T primers逆转录实验发现circ ARNTL2在Random 6 mers primer逆转后表达量远大于Oligo d T primer逆转后表达量(p<0.001)。RNase R实验证明circ ARNTL2耐受RNase R消化。Sanger测序确定circ ARNTL2存在反向剪切序列。RNA核质分离实验发现circ ARNTL2在细胞质中的表达量高于细胞核。卡方检验发现circ ARNTL2的表达情况与TNM分期(p=0.015)、淋巴结转移(p=0.014)相关。ROC曲线中AUC为0.8115,灵敏度为72.73%,特异度为88.64%。沉默circ ARNTL2后,CAL27和SCC9细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强(p<0.05),细胞凋亡率升高(p<0.05),细胞周期阻滞在S期(p<0.05)。干扰circ ARNTL2增加剪切caspase-3蛋白含量(p<0.05),同时提高E-钙粘蛋白和降低N-钙粘蛋白表达量(p<0.05)。结论:本研究成功构建TSCC中circ RNAs的表达谱,筛选出circ ARNTL2在TSCC组织和细胞系中表达上调。证实了circ ARNTL2的成环特性,确定circ ARNTL2主要位于细胞质中。circ ARNTL2可能参与TSCC淋巴结转移和TNM分期,作为潜在的生物标志物,对TSCC具有一定的诊断价值。circ ARNTL2促进TSCC细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡,影响细胞周期,在TSCC发生发展过程中起到促癌基因样的作用。
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