【摘 要】
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目的:1.研究miR-26a对恶性黑色素瘤耐药的影响。2.研究miR-26a在恶性黑色素瘤耐药中的作用机制。方法:1.检测miR-26a在达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞系中的表达:使用不同浓度的达拉菲尼（0,30,100,300n M）对恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624处理24小时后,利用免疫印迹法（Western Blot,WB）和定量PCR（Quantitative Polymerase
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目的:1.研究miR-26a对恶性黑色素瘤耐药的影响。2.研究miR-26a在恶性黑色素瘤耐药中的作用机制。方法:1.检测miR-26a在达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞系中的表达:使用不同浓度的达拉菲尼（0,30,100,300n M）对恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624处理24小时后,利用免疫印迹法（Western Blot,WB）和定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）检测LC3I/II的表达水平,进行自噬水平分析。另外用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）进行细胞存活率测定。从而得到使恶性黑色素瘤细胞系耐药的最适浓度。用最适浓度（100n M）的达拉菲尼处理恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624后,通过qPCR检测miR-26a的表达水平。2.检验miR-26a的上调对达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞的自噬水平和凋亡程度的影响:用GFP-MAP1LC3质粒和阴性对照miRNA（Negative Control miRNA,miR-NC）或miR-26a模拟物转染恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624,然后将这些细胞用达拉菲尼（100 n M）处理24小时。通过共聚焦显微镜分析细胞内GFP阳性点百分比,以及利用Western Blot和qPCR分别在蛋白和mRNA水平检测cleaved PARP的表达,从而得到细胞的自噬水平和凋亡程度,以检验miR-26a对恶性黑色素瘤耐药的影响。3.检测上调miR-26a表达后达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞中高迁移率组蛋白（High Mobility Group Box 1,HMGB1）的表达水平:使用miR-NC或miR-26a模拟物转染恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624,然后将这些肿瘤细胞用达拉菲尼（100 n M）处理24小时后,利用Western Blot检测HMGB1蛋白水平。4.检验沉默HMGB1表达对达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞自噬水平和凋亡程度的影响:用GFP-MAP1LC3质粒和非目标对照sh RNA（Non-target control sh RNA,NTC sh RNA）或HMGB1 sh RNA转染恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624。并用达拉菲尼（100 n M）处理这些细胞24小时。接着利用Western Blot检测cleaved PARP的蛋白表达水平,并利用qPCR进行定量分析,以分析细胞的凋亡程度。同时通过在共聚焦显微镜下检测GFP-LC3阳性点百分比以及LC3I/II的Western Blot和qPCR检测,进行自噬水平分析。观察miR-26a是否通过介导HMGB1发挥其对抗恶性黑素瘤细胞耐药的作用。结果:1.在用最适浓度（100n M）的达拉菲尼处理A375和MEL624细胞系得到达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞系后,发现miR-26a的表达水平显著下调。2.用miR-26a模拟物转染恶性黑色素瘤细胞系A375和MEL624,上调miR-26a表达,并用达拉菲尼（100n M）处理后,这些细胞GFP-LC3阳性点的百分比显著减少,并且cleaved PARP的表达水平明显上调,说明miR-26a的上调抑制了达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞的自噬并促进其凋亡。3.通过上述相同方法得到miR-26a表达上调的肿瘤细胞系,并用达拉菲尼（100n M）处理。发现在这些细胞内HMGB1的表达水平显著下调。4.用HMGB1 shRNA转染A375和MEL624细胞系,沉默HMGB1表达,并用达拉菲尼（100n M）处理。通过GFP-LC3阳性率分析、Western Blot和qPCR检测手段,发现这些细胞内GFP-LC3阳性点形成减少以及LC3I/II水平显著下调,另外cleaved PARP表达水平上调。说明沉默HMGB1表达会抑制达拉菲尼耐药恶性黑色素瘤细胞的自噬并增强其凋亡。结论:1.miR-26a削弱了恶性黑色素瘤细胞耐药的产生。2.miR-26a通过靶向HMGB1发挥其对抗恶性黑色素瘤细胞耐药的作用。
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