【摘 要】
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目的探讨miR-194-5p对其靶基因TSP-1在高糖环境下培养的肾小管上皮细胞中的表达变化;观察肾小管上皮细胞在高糖环境下过表达miR-194-5p,并通过Western Blot检测TSP-1、Bcl-2、Bax蛋白的表达变化,探讨miR-194-5p在肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制,为寻找糖尿病肾病的新治疗靶点提供一定的理论依据。方法将人肾小管上皮细胞进行体外培养,按如下分组:（1）分为正
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目的探讨miR-194-5p对其靶基因TSP-1在高糖环境下培养的肾小管上皮细胞中的表达变化;观察肾小管上皮细胞在高糖环境下过表达miR-194-5p,并通过Western Blot检测TSP-1、Bcl-2、Bax蛋白的表达变化,探讨miR-194-5p在肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制,为寻找糖尿病肾病的新治疗靶点提供一定的理论依据。方法将人肾小管上皮细胞进行体外培养,按如下分组:（1）分为正常组、高糖组在37℃、5%的CO2中培养48小时后,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测两组细胞内的miR-194-5p的表达变化及蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测TPS-1蛋白的表达变化;（2）通过转染miR-194-5p mimic构建miR-194-5p的过表达,将其分为四组:正常组（5.6mmol/L）、高糖组（30mmol/L）、高糖+miR-NC转染组、miR-194-5p mimic转染组培养48小时,通过qRT-PCR检测miR-194-5p的转染效率,采用Western Blot检测各组细胞中TSP-1、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）的蛋白表达变化,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）的水平;（3）通过Target Scan生物信息学预测miR-194-5p与TSP-1的结合位点并进行突变,利用双荧光素酶报告实验证实。结果1.在高糖诱导的HK-2细胞中miR-194-5p、TSP-1的表达变化:在高糖环境培养下,miR-194-5p的表达出现下降,TSP-1蛋白表达水平上升,推测miR-194-5p及TSP-1可能参与了DKD的发病进程。2.在高糖环境下过表达miR-194-5p通过调控靶基因TSP-1挽救肾小管上皮细胞损伤,通过qRT-PCR检测出转染miR-194-5p mimic组中肾小管上皮细胞的miR-194-5p表达上升,并通过western Blot检测出TSP-1、Bax蛋白的表达下降,Bcl-2的表达上升。3.根据Target Scan生物信息学软件预测miR-194-5p与TSP-1的3’UTR存在结合位点,构建双荧光素酶载体报告基因并验证了miR-194-5p的靶基因为TSP-1。本研究发现miR-194-5p在高糖环境下肾小管上皮细胞中表达下降,通过Target Scan生物信息学预测、qRT-PCR以及Western Blot推测TSP-1是miR-194-5p的靶基因;双荧光素酶报告基因检测验证了TSP-1与miR-194-5p的直接结合。结论miR-194-5p在高糖环境下可通过转录后水平下调靶基因TSP-1表达而挽救肾小管上皮细胞的损伤。
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