目的:结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均位居前三位。约50%的患者存在远处转移,Ⅳ期结直肠癌患者的五年生存率不足10%。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在治疗血液癌中已取得显著疗效,但仍难以攻克实体瘤,且存在严重细胞因子风暴、神经毒性等风险。自然杀伤(natural killer,NK)细胞在安全性、可及性上更优于T细胞,因此我们拟通过使用NK细胞作为NKG2D CAR的修饰载体,评估NKG2D CAR-NK细胞用于治疗结直肠癌晚期患者的安全性和可行性。方法:通过使用电穿孔的方法对NK细胞进行NKG2D mRNA CAR的修饰,利用流式细胞分析检测、IFN-γ酶联免疫斑点试验和细胞毒性杀伤试验检测NKG2D CAR-NK细胞的体外杀瘤能力。使用HCT116-luc结直肠癌细胞系构建NSG小鼠模型,通过活体动物成像技术和Kaplan-Meier生存分析来检测NKG2D CAR-NK细胞的体内抑瘤效果。进一步通过开展一项单臂、开放、剂量递增的单中心的初期临床研究(NCT03415100)来评估NKG2D CAR-NK细胞治疗的安全性和可行性,入组3例经标准治疗失败的腹膜转移性结直肠癌患者。结果:研究发现NKG2D-DAP12 CAR-NK细胞比NKG2D-CD3ζCAR-NK细胞呈现更强的IFN-γ分泌能力和细胞毒性免疫反应。在人结直肠癌NSG小鼠模型中显示了NKG2Dp CAR-NK细胞治疗组和对照组相比具有显著的抑瘤效果,并有效延长中位生存时间。随后,采用局部输注NKG2Dp CAR-NK的方式治疗了3例转移性结直肠癌患者。前两例患者腹腔输注低剂量CAR-NK细胞后,可观察看腹水生成量减慢以及腹水样本中肿瘤细胞的数量急剧减少。第三例肝转移瘤患者采用超声引导下瘤内经皮注射和腹腔内灌注方式输注CAR-NK细胞后,多普勒超声可见肝部肿瘤快速缩小,正电子发射断层扫描(positron emission tomography-computer tomography,PETCT)提示经治疗的肝病灶为完全代谢反应。3例患者在治疗过程中均无出现3级或以上的不良事件。结论:本项研究结果初步显示NKG2D mRNA CAR-NK细胞局部输注治疗转移性结直肠癌患者具有安全性和可行性,为肿瘤免疫治疗提供了一种新的策略。