滞育激素(DH)是诱导卵滞育的激素，最近的研究表明，DH活性可能广泛存在于昆虫中，但在已研究的昆虫中，其只在家蚕中作为滞育的调控子(Denlinger，2002)。说明DH在进化上比较特殊，因此研究DH，不仅有助于探明滞育机理，而且对DH的分子进化研究也有重要作用；对DH分子进化的研究可以反过来可以推动滞育机理的研究，两者相辅相成。滞育机理的研究为利用益虫如改造家蚕的滞育类型以及生物防治害虫奠定理论基础。因此DH的研究具有十分重要的意义。 家蚕分子生物学研究结果表明性信息素合成激活肽(PBAN)与DH为同一基因编码，该基因在翻译水平剪切成DH、PBAN及其它三种神经肽，这种加工方式在昆虫中是不多见的。PBAN是控制昆虫性信息合成的神经肽，在昆虫防治上具有广阔的应用前景，因此研究PBAN不仅具有理论上的意义，还具有潜在的应用价值。 由于家蚕起源于中国野桑蚕，故研究中国野桑蚕DH-PBAN基因，对探明作为重要经济昆虫和模式生物的家蚕DH-PBAN基因的功能、基因的进化以及家蚕起源与进化等均有重要意义。 为此：本研究重点在克隆获得中国野桑蚕DH-PBAN基因，并利用网上数据库资源进行序列分析及系统进化分析，为研究DH、PBAN及DH-PBAN基因功能奠定基础，同时研究野蚕与家蚕的进化。 本实验根据家蚕DH-PBAN基因设计引物，分段扩增中国野桑蚕DH-PBAN基因，主要结果如下： 1、首先建立了用特异引物从野桑蚕基因组中扩增目的基因或基因片段(尤其是单拷贝基因)比较稳定的PCR体系。该体系对于用特异引物从野桑蚕基因组中扩增其它基因或基因片段具有较好的借鉴作用。体系中影响扩增效果的关键因素是基因组DNA的纯度、浓度及引物浓度。 2、设计特异引物分段从中国野桑蚕基因组中扩增中国野桑蚕DH-PBAN基因，克隆、测序、拼接后首次获得了中国野桑蚕DH-PBAN基因全序列，序列全长5520bp，通过同源比对、结构分析，表明，该序列由6个外显子和5个内含子组成，编码DH、PBAN、α-SGNP、β-SGNP及γ-SGNP。中国野桑蚕DH-PBAN基因与家蚕DH-PBAN基因同源性为94％，DH-PBAN基因变化以序列的插入/缺失为主。与中国野桑蚕DH-PBAN相比，家蚕DH-PBAN第3内含子中插入了298bp长的片段，而第5内含子中却缺失了64bp长的片段。这种大片段的变化在DH-PBAN基因进化研究上是否具有意义，还有待进一步研究。中国野桑蚕DH-PBAN基因DNA序列比对结果说明DH-PBAN基因外显子在维持DH-PBAN的功能方面具有重要作用。 3、本试验利用DNAstar软件包的Protean(Nishikawa & Ooi，1987)对中国野桑蚕DH-PBAN氨基酸序列、生化性质等进行了分析，结果表明该多肽全长192，分子量为22271.46m. w.,1A(280)=1.29mg/mL，等电点为9.12，PH7时带电量为4.23。利用在线蛋白质结构分析软件Tmpred(Prediction of Transmembrane Regions and Orientation)进行蛋白质结构分析，表明前20多个氨基酸为引导肽。 4、对DH、PBAN及其基因cDNA、DNA序列进行同源比对，结果表明DH功能区域为C端六肽，PBAN功能区域为C端五肽。i 根据DH＿PBAN及其基因cDNA序列构建的分子进化树反映中国野桑蚕、家蚕和日本野桑蚕三者二间的关系主要有两类：一是中国野桑蚕和家蚕先聚在一起，然后再与日本野桑蚕聚在一起＿二g？③④4＠M6＊③8＠X＄R－＠，M6RS＆8③R－＠，＠a＆8＊WB＃。g＠SS＆聚在一起的情况。经综合分析，推测中国野桑蚕与日本野桑蚕共同起源于同一个祖先——吉野蚕＿家蚕再从中国野桑蚕中分化出来，其进化路线示意图如下图所示。 ＿日本野桑蚕 — —q野蚕一一一二一＼了一一中国野桑蚕 ”家蚕 中国野桑蚕、家蚕与日本野桑在进化路线示意图 6、根据DH、PBAN及其基因cDNA、DNA序列所做的进化树结果，分析相关昆虫基同进化及物种聚类情况，表明绝大多数与传统的形态聚类结果比较一致，但也有差异。推论可能是有些昆虫所处环境比较特殊。 7、将以卵滞育的野桑蚕、家蚕与以蛹滞育的烟实夜蛾、棉铃虫的DH－PBAN进行比较，结果表明，两种滞育类型昆虫DH－PBAN序列的差异主要集中在前24个氨基酸，即主要为引导肚部分。推论DH－PBAN引导肽在决定昆虫滞育类型或决定DH的作用形式上可能具有重要的作DJ。