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背景原发性肝癌是人体最常见的恶性肿瘤之一,而其中约90%为肝细胞癌（HCC）。虽然近年来肝癌诊断技术和治疗手段的不断提高,但是肝癌复发和肝癌转移病人的预后始终不佳,肝癌转移的发生和进展机制尚未清楚。外泌体（Exosome）是细胞分泌的一种直径大小约为30-150nm的细胞外囊泡,外泌体载有非编码RNA（如miRNA）,信使RNA和蛋白质等信号分子,在细胞信号交流中发挥着十分重要的作用。miRNA是外泌体中含量最多的非编码RNA,近年来,多种miRNA已经被证明在癌症发生发展过程中发挥着不可或缺的作用。但是,外泌体miRNA在肝癌细胞转移、肿瘤进展的具体作用以及内在机制仍有待进一步的探索研究。目的本研究旨在通过外泌体miRNA测序分析不同转移能力肝癌细胞中的差异外泌体miRNA,并找在肝细胞癌转移能力变化过程中发挥重要作用的miRNA;探讨其在HCC发生发展和转移过程中的具体作用;并且进一步探索目标miRNA的下游调节机制;解析调节miRNA表达的上游调节因子,为转移性HCC提供诊断治疗新思路。方法通过在亲代肝癌细胞系（MHCC-97h和Huh7）上通过持续施加选择性压力,构建具有高转移能力的子代HCC细胞株（97hm和Huhm）。其次,通过共培养实验以及体内肺转移实验验证了高转移性肝癌细胞对于低转移性肝癌细胞的影响。经过富集细胞上清以及高速离心处理获得了肿瘤外泌体,并通过对亲代肝癌细胞株以及其进化而来的高转移性肝癌细胞株的外泌体内容物进行外泌体miRNA测序分析,在差异性miRNAs中分析得到丰度最高的miR-92a-3p。随后在肝癌细胞及其外泌体,和小鼠体内转移模型的血浆和临床肝癌病人血浆样本中进行了RT-PCR验证了miR-92a-3p的水平。随后实验中采用miR-92a-3p mimics过表达miR-92a-3p,使用inhibitor（体外）和antigomiR（体内）来敲低miR-92a-3p水平,通过CCK8,克隆形成和体内皮下成瘤实验验证miR-92a-3p对于肝癌细胞增殖能力的影响,通过transwells实验,侵袭迁移实验,尾静脉肺转移实验,脾静脉肝转移实验验证miR-92a-3p对于肝癌细胞转移能力的影响。机制方面,通过生物信息学网站预测miR-92a-3p的潜在靶基因,通过RT-PCR和荧光素酶双报告基因系统分析miR-92a-3p的靶基因以及结合位点。对于上游调节基因,通过对不同转移能力肝癌细胞的转录组测序以及生物信息学网站预测miR-92a-3p的潜在调节性转录因子,并且通过RT-PCR,染色质免疫沉淀实验（Ch IP）和荧光素酶双报告实验分析转录因子E2F1和C-myc对于miR-92a-3p的转录激活作用。结果1.高转移性肝癌细胞的外泌体能将高转移潜力传递给低转移性肝癌细胞。高转移性肝癌细胞来源的外泌体能提高受体肝癌细胞在Transwell实验中的转移能力,并且促进了肝癌细胞的体内肺转移能力。2.在外泌体miRNA测序结果分析所得差异性miRNAs中（p值小于0.05）,miR-92a-3p是高转移性肝癌细胞外泌体中丰度最高的miRNA。RT-PCR实验结果指出,miR-92a-3p无论是在高转移性肝癌细胞的外泌体和肺转移小鼠血浆外泌体中相对于对照组均呈现高表达状态。在小鼠肿瘤模型中,外泌体miR-92a-3p水平随着肝癌的发展而增加。在临床样本中,外泌体miR-92a-3p在转移性肝癌病人血浆中有着更高的表达,血浆外泌体高水平miR-92a-3p与HCC患者的不良预后相关。3.生物学功能方面,体内外实验数据表明,过表达miR-92a-3p之后,肝癌细胞的增殖能力和侵袭迁移能力得到提高,与之相反,抑制miR-92a-3p则显著抑制肝癌细胞的增殖能力,成瘤能力和体内外转移能力。并且western blot实验指出,miR-92a-3p通过降低E-cadherin,促进β-catenin,snail等蛋白的表达促进上皮间质转变。4.通过miRNA数据库分析miR-92a-3p潜在靶基因,RT-PCR结果指出miR-92a-3p明显降低PTEN的m RNA水平。荧光素酶双报告实验指出miR-92a-3p能直接结合在PTEN的3’-UTR区,从而抑制PTEN的表达。而且western blot结果指出miR-92a-3p能通过抑制PTEN的表达促进p-akt/snail通路,从而促进肝癌转移。而且过表达PTEN之后能抵消过表达miR-92a-3p所引起肝癌细胞转移能力的增加。5.不同转移能力的肝癌细胞转录组测序结果和生物信息学网站预测指出的E2F1和C-myc是miR-92a-3p的潜在调节性转录因子。RT-PCR结果指出,高转移性肝癌细胞含有更高水平的E2F1和C-myc,并且过表达E2F1和C-myc促进miR-92a-3p的表达,染色质免疫沉淀实验证明E2F1和C-myc可以直接结合在miR17HG的启动子上游,荧光双报告实验说明E2F1和C-myc直接转录激活miR-92a-3p从而促进其表达。结论1.与低转移性肝癌细胞相比,高转移性肝癌细胞外泌体中含有高水平的miR-92a-3p,而且转移性肝癌病人其血浆中外泌体miR-92a-3p呈现高表达水平,并且高水平血浆外泌体miR-92a-3p和肝细胞癌患者的不良预后相关。2.在体外细胞实验和体内动物实验中,过表达miR-92a-3p促进肝癌细胞的增殖,侵袭迁移和转移。而抑制miR-92a-3p则能抑制肝癌细胞的增殖,减弱其成瘤能力和转移能力。3.miR-92a-3p通过靶向结合于PTEN的3’-UTR从而抑制PTEN的表达,促进了Akt的磷酸化和Snail的表达,从而促进肝癌细胞上皮间质转变和肝癌转移。4.在上游调节机制上,转录因子E2F1和C-myc能直接结合于miR-92a-3p的宿主基因miR17HG的启动子上游区域,转录激活miR-92a-3p,从而促进转移性肝癌的发生发展。