芦丁鼠李糖苷酶的酶性质及异槲皮苷的纯化精制

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本论文采用微生物酶解法,以黄酮苷类物质芦丁为底物,利用微生物Absidia sp.R9g菌产的芦丁-α-鼠李糖苷酶水解芦丁侧链上的鼠李糖苷键,制备活性更高的异槲皮苷以及鼠李糖。采用大孔吸附树脂对产物进行分离精制,为工业化生产异槲皮苷提供了理论依据。对芦丁-α-鼠李糖苷酶进行分离纯化,测定酶蛋白分子量,并对其酶性质和反应特异性做了研究。对产芦丁-α-鼠李糖苷酶的Absidia sp.R9g菌株进行发酵培养,优化了粗酶液的反应条件,确定最适酶反应条件为:最佳底物浓度4%、最佳反应时间6h、最佳温度50℃、最佳pH值5.0。在最优反应条件下进行酶反应,24.0g底物芦丁经酶反应后,得到异槲皮苷和鼠李糖的混合产物溶液,浓缩后利用SP207分离得到异槲皮苷的粗品,粗品经精制后得到8.01g纯品,得率为33.3%。异槲皮苷纯品通过高效液相色谱法检测,其纯度为98.3%。利用DEAE-Cellulose DE52柱对微生物Absidia sp.R9g菌发酵产生的芦丁-α-鼠李糖苷酶进行分离提纯,用SDS-PAGE对该酶进行了纯度检测及蛋白分子量测定,确定其分子量为66kDa。对该酶的性质研究表明:其最适反应pn是5.0,pn稳定范围是4.0-8.0;最适反应温度是50℃,在60℃以下稳定。金属离子K+、Na+、Zn2+、Mg2+、Ca2+对酶反应影响均不大;而Cu2+离子则对其有很明显的抑制作用,且浓度越高,抑制作用越明显。最大反应速度Vmax=56.1mmol/L·h,米氏常数Km=11.7mmol/L。
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