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目的1.通过运用肾气丸提取液给新西兰白兔灌胃,用高效液相色谱法(HPLC)检测其在灌胃前及灌胃后不同时间点桂皮醛血药浓度,计算分析其药代动力学各项参数,探讨其在体内的吸收、分布及代谢等情况。2.通过建立肾阳虚小鼠模型,观察肾气丸组方中各成分不同剂量配比对肾阳虚模型小鼠临床症状、血清促肾上腺皮质激素(ACTH)及皮质醇(COR)含量的改善情况,寻找肾气丸组方的最佳剂量配比,为临床更有效地运用肾气丸防治疾病提供可靠依据。方法1.肉桂药材质量控制研究方法：肉桂药材,打粉后,过三号筛。取肉桂粉末0.2g,精密称取,置于100m1圆底烧瓶中,加入70%乙醇54ml,密塞,冷浸30min,加热回流提取1h,趁热过滤,滤渣用70%乙醇多次洗涤,滤液转移至100m1容量瓶中,定容至刻度,摇匀。取少量经0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液,注人高效液相色谱仪测定含量。色谱条件为：色谱柱Diomonsil TM C18(5μm,4.6mm×250mm)；柱温为室温；流动相为甲醇-水(65：35,v/v)；流速1m1/min；检测波长275nm；进样量10μL。2.肾气丸有效成分桂皮醛的药代动力学初步研究方法：精密称取肾气丸含肉桂2.5g(附子、肉桂、干地黄、山药、山茱萸、丹皮、泽泻、茯苓1：1：8：4：4：3：3：3),用10倍量70%乙醇对肾气丸组方药物进行加热回流提取60分钟,减压回收溶剂,并浓缩至肾气丸全方浓度为1g/m1,给新西兰白兔灌胃。并分别于灌胃前,及灌胃15、30、50、70、85、95、105、120、140、160、180、200、240min于兔耳缘静脉取血lml。采用基质固相分散(MSPD)萃取方法处理含药全血样品。色谱条件为：色谱柱Di omonsil TM C18(5μm,4.6mm×250mm)；柱温为室温；流动相为甲醇-水(65：35,v/v)；流速m1/min;检测波长275nm；进样量50μL。用药代动力学统计软件DAS2.1.1对HPLC检测结果进行统计分析。3.肾气丸组方优化初步研究方法：将昆明种小鼠随机分为19组,每组10只。按响应面设计方案,其中17组为中药组,1组为空白组,1组为模型组。小鼠在适应性喂养1周后,除空白组小鼠外,其余组小鼠均每天腹腔注射氢化可的松注射液25mg/kg.d-1制造肾阳虚小鼠模型,连续10d。同时中药组灌胃给予肾气丸中药水煎液,空白组、模型组给予等体积生理盐水,连续给药20d。于给药后的第21天上午8时,摘除小鼠眼球取血0.3m1,置离心管内静置1h,离心10min,转速4000r/mi n,取上层血清,存于-20℃冰箱待测。观察各组小鼠肾阳虚临床症状变化情况,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清中促肾上腺皮质激素(ACTH).皮质醇(COR)的含量。用Design ExpertV.8.0.5b统计软件对ELISA测得的实验数据进行统计学分析。结果1.肉桂药材质量控制研究结果：6批肉桂药材中桂皮醛含量均在2.4%以上,大于药典中规定1.5%,符合药典规定,说明肉桂醛含量稳定,可用于肾气丸灌胃液的制备。2.桂皮醛的药代动力学各项参数结果：建立桂皮醛的标准曲线方程为Y=111298x+2397.6, r=0.9992,桂皮醛在0.063~6.3μg/mL范围内线性关系良好,最低检测浓度为0.0315μg/mL,保留时间为6.7min左右。新西兰白兔予肾气丸灌胃后,桂皮醛经1.72h可达最大吸收峰,峰浓度为(Cmax)为6.26mg/L,t.2为0.446h,以AIC最小值为参考,桂皮醛在兔体内的药动学过程符合一室模型。3.肾气丸组方优化结果：在组方优化研究中,分别建立了小鼠含药血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(COR)含量的多元二次响应面回归模型,得拟合方程：YACTH=14.32213+16.55723X1-6.84099X2-9.26621X3+6.94731X1X2-11.47842X1X3+0.11478X2X3-37.78926X,2+1.74038X:2+7.041112X32YCOR=17.10794+14.39793X1-7.68334X2-10.22769X3+8.36777X1X2-11.01928X1X3-0.37305X2X3-40.22727X.2+2.01543X22+8.00224X32其中,Y是效应值促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇含量,X1、X2和X3为自变量,即(肉桂+附子)X.、(干地黄+山药+山茱萸)X：和(丹皮+泽泻+茯苓)X3和。各因素与指标之间不是简单的线性关系,而是二次关系。经Design ExpertV.8.0.5b统计软件分析后得出,小鼠肾气丸最佳使用剂量为(肉桂+附子)X10.256g、(干地黄+山药+山茱萸)X21,435g和(丹皮+泽泻+茯苓)X31.160g。在此条件下,取得的小鼠血清ACTH含量为12.8137pg/ml,COR含量为14.1529pg/ml。考虑到实际应用及方差分析结果,确定小鼠肾气丸最佳使用剂量为：肉桂0.15g、附子0.15g、干地黄0.56g、山药0.28g、山茱萸0.28g、丹皮0.42g、泽泻0.42g、茯苓0.42g。并按此条件进行验证实验,测得小鼠血清ACTH含量为12.02pg/ml, COR含量为13.63pg/ml。根据实验结果,并结合临床实际应用情况,以及普通高等教育中医药类规划教材《方剂学》书本记载：肉桂3g、附子3g、干地黄24g、山药12g、山茱萸12g、丹皮9g、泽泻9g、茯苓9g,推断若将肾气丸组方中肉桂和附子剂量增加一倍,干地黄、山药、山茱萸保持不变,丹皮、泽泻、茯苓亦增加一倍,即肾气丸中各药物配伍比例调整为：附子、肉桂、干地黄、山药、山茱萸、丹皮、泽泻、茯苓2：2：8：4：4：6：6：6,其对肾上腺皮质功能低下的调节作用更加显著,温补肾阳作用最佳。结论1.实验证实了在全血样品中,高效液相色谱法(HPLC)可以测得桂皮醛。并且,建立了肾气丸中有效成分桂皮醛在全血样品中的HPLC测定方法,实验证实该方法稳定,灵敏性较好,准确性较高,但回收率较低。2.各项药动学参数显示,肾气丸中桂皮醛在机体内代谢、消除较快,维持有效血药浓度的时间较短。3.肾气丸原方剂量相对偏低,若将肾气丸组方中肉桂和附子剂量增加一倍,干地黄、山药、山茱萸保持不变,丹皮、泽泻、茯苓亦增加一倍,即肾气丸中各药物配伍比例调整为：附子：肉桂：干地黄：山药：山茱萸：丹皮：泽泻：茯苓(2：2：8：4：4：6：6：6),其对肾上腺皮质功能低下的调节作用更加显著,温补肾阳作用最佳。