背景:宫颈癌是世界上女性发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤,高危型人乳头瘤病毒（High risk HPV,HR-HPV）持续性感染是宫颈癌主要原因,其中HPV16感染占所有宫颈癌病例50%以上。在我国,宫颈癌发病率呈上升趋势和发病年龄呈年轻化趋势。目前对宫颈癌治疗还局限于手术、放化疗,这些方法能够清除受损组织,同时也残留已被HPV感染的细胞,因而常常导致复发,甚至转移。已上市的宫颈癌预防性疫苗被证明对宫颈癌和已被HPV感染的患者没有治疗作用。因此,研究治疗宫颈癌药物和治疗性疫苗非常迫切和必要。在HPV致病基因中,HPVE6和E7分别与细胞内抑癌因子p53和pRb相互作用,在细胞周期调控及凋亡调节中起重要干扰作用,导致细胞永生化和转化,并且E6和E7表达是维持宫颈癌必需,常被视为HPV感染相关的肿瘤相关性抗原。此外,E7还影响宿主对感染的耐受和免疫功能,与宿主蛋白同源性小,因而常被研究者作为宫颈癌重要的治疗药物作用和疫苗设计的靶点。包括宫颈癌在内的肿瘤免疫治疗被视为继手术、放疗和化疗之后的治疗肿瘤的一种重要方法。树突状细胞（DCs）作为体内最有效的专职抗原递呈细胞,在先天性免疫和获得性免疫中起中心作用。成熟DCs高表达的MHC分子与肿瘤抗原结合后,递呈给CD4+T细胞,使之活化并发挥抗瘤效应,或递呈给CD8+T细胞以产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞,发挥抗瘤效应。目前已经有多种DCs相关生物治疗方案用于疾病治疗,并取得了一定效果,如2010年被FDA批准治疗难治性前列腺癌的DCs疫苗---sipuleucel-T（也称为APC8015）。但DCs疫苗真正引起临床反应的不多见,主要原因是机体处于对肿瘤的免疫耐受。细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）是一类由细胞产生并反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负调节因子。SOCS1参与了经典的JAK/STAT,TLR等信号通路的调节,并在DCs和T细胞的成熟和分化起重要作用。同时,SOCS1还能够调节IFN-Y、IL-4、IL-12、和IL-15等细胞因子的分泌。研究表明,SOCS1沉默可以消除DCs自身耐受和自身免疫性病理反应,对以DCs为基础的抗肿瘤疫苗研究具有重大意义。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIKs）对肿瘤的治疗是近年来用于临床肿瘤治疗的辅助治疗,由于其在体外细胞因子IFN-γ、IL-2和抗CD3抗体的作用下易扩增、具有非限制的T细胞和NK细胞的特征,对肿瘤具有杀伤作用且无毒性,适合同种和自身的免疫细胞治疗。此外,DCs激活后与CIKs共培养能加强CIKs对肿瘤细胞的杀伤和肿瘤的治疗,但其机制尚未完全明了。目的:本课题旨在研究以去HPV16E7转化活性的重组mE7为特异性宫颈癌肿瘤相关抗原,作为天然免疫抑制因子的抑制子---沉默SOCS1的DCs疫苗和DCs-CIKs强化对宫颈癌模型的免疫治疗。方法:本课题采用定点突变的方法突变HPV16E7转化活性相关位点,然后克隆被突变的 HPV16E7,即 HPV16mE7,构建重组质粒 pET-28a-HPV16mE7,转化 B121（DE3）后在0.5μmol/L IPTG诱导下高表达,采用Ni2+树脂层析柱对表达的mE7进行纯化,用Western Blot分析突变的HPV16E7,对mE7进行鉴定,以及分析对其抗原性的影响。用淋巴细胞分层液从人的外周血或小鼠骨髓分离单核细胞,在细胞因子GM-CSF和IL-4的诱导下,体外培养DCs细胞,用光学显微镜观察细胞的形态和流式细胞仪分析DCs特异表达的表面分子,以及在脂多糖（LPS）刺激下,用流式细胞仪分析对DCs成熟的影响。CIKs的培养采用人外周血或小鼠脾细胞分离单个核细胞,在细胞因子IFN-γ、IL-1α、IL-2和抗CD3抗体的诱导下培养,用流式细胞仪分析其表型,如CD3、CD4、CD8和CD56。为了研究DCs细胞疫苗和DCs-CIKs对宫颈癌的治疗效果,我们采用组成表达HPV16E6E7的TC-1接种C57BL/6小鼠制备宫颈癌的动物模型。本研究还利用复制缺陷型腺病毒载体构建重组腺病毒Ad-sh-SOCS1和Ad-sh-mSOCSl（SOCS1的突变体）,对重组的腺病毒载体用PCR和测序鉴定,鉴定正确的重组病毒载体用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染293T细胞,收获的重组腺病毒用腺病毒纯化试剂盒纯化,计算病毒滴度后,感染小鼠B16和DCs细胞,用Western Blot和定量RT-PCR分析重组腺病毒对SOCS1基因的沉默。我们先用HPV16mE7脉冲培养DCs细胞后,与CIKs细胞共培养,用乳酸脱氢酶释放实验检测其对宫颈癌细胞TC-1的杀伤作用、CTL反应,用ELISA检测细胞因子IFN-γ,用HPV16mE7脉冲的DCs-CIKs（106）治疗接种TC-1荷瘤小鼠,检测其肿瘤的体积大小和小鼠存活情况。接下来,我们用感染复数为50的重组腺病毒感染培养的DCs,使SOCS1沉默,并用流式细胞仪检测对DCs表面分子,如CD40、CD80、CD83和CD86表达的改变,再用HPV16mE7脉冲沉默的DCs,在LPS刺激下成熟,用DCs疫苗免疫小鼠,用释放实验检测CTL反应,用ELISA检测IFN-γ水平。再用动物模型研究DCs疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用和肿瘤细胞对已免疫小鼠的攻击作用。为了研究DCs加强CIKs特异杀伤的机制,用SOCS1沉默和HPV16E7.49-57表位肽脉冲的DCs后,用流式细胞分析仪检测表面分子CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-I表达水平,用ELISA分析上述处理的共培养上清液的细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-12p70和IL-1 β,在DCs-CIKs共培养液中加入抗IL-12抗体,用释放实验检测对TC-1的杀伤活性。采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,不同感染分组与刺激分组,或不同感染分组与比率分组采用两因素析因统计方法进行分析,如存在交互作用,利用单因素方差分析（one-way ANOVA）进一步分析其单独效应,当P<0.05,差异具有统计学意义。结果:DNA测序分析表明与HPV16E7转化活性相关的位点突变成功,重组质粒pET-28a-HPV16mE7双酶切和DNA测序证明成功构建了重组质粒,用SDS-PAGE、Western Blot和ELISA分析证明了我们构建的质粒在B121（DE3）能表达,突变的HPV16E7的免疫原性没有受到影响。流式细胞仪对培养的DCs和CIKs分析证明了用细胞因子能够在体外扩增获得DCs和CIKs细胞。DNA测序和PCR检测所构建的Ad-sh-SOCS1和Ad-sh-mSOCS1正确,重组腺病毒感染小鼠和DCs细胞,能抑制SOCS1的表达,且与感染的剂量有关。ELISA试剂盒检测在LPS的刺激下HPV16mE7脉冲的DCs感染Ad-shRNA-SOCS1后各种细胞因子如IL-6、IL-12、TNF-α的水平情况,同时刺激分组以未用LPS为对照,感染分组以PBS、Ad-shRNA-mSOCS1为对照。在不同刺激和不同感染条件下,两因素析因分析结果显示:（1）不同感染条件下（PBS、Ad-shRNA-mSOCS1、Ad-shRNA-SOCS1）,IL-6、IL-12和TNF-α水平差异具有显著统计学意义（IL-6:F感染分组=176.367,P<0.01;IL-12:F感染分组=2979.755,P<0.01;TNF-α:F感染分组=7382.292,P<0.01）。（2）不同刺激条件下（NoLPS和LPS）,IL-6、IL-12和TNF-α水平差异具有显著统计学意义（IL-6:F刺激分组=483.471,P<0.01;IL-12:F刺激分组=14162.505,P<0.01;TNF-α:F刺激分组=13260.004,P<0.01）。（3）不同感染和刺激条件下具有交互作用,在LPS刺激和Ad-shRNA-SOCS1感染条件下,IL-6、IL-12和TNF-α水平最高（IL-6:F感染*刺激=203.101,P<0.01;IL-12:F感染*刺激=3176.630,P<0.01;TNF-α:F感染*刺激=6861.513,P<0.01）。进一步分析各因素的单独效应,结果如下:（1）IL-12:PBS,Ad-shRNA-mSOCS1 与 Ad-shRNA-SOCS1 三者之间两两比较,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）IL-6:PBS 与 Ad-shRNA-mSOCS1 比较P= 1.83,P>0.05,差异无统计学意义,PBS与Ad-shRNA-SOCS1比较P=260.29,P<0.05差异有统计学意义,Ad-shRNA-SOCS1 与 Ad-shRNA-mSOCS1 比较 F =277.83,P<0.05差异有统计学意义。（3）TNF-α:PBS与Ad-shRNA-mSOCS1比较F =0.83,P>0.05,差异无统计学意义,PBS 与 Ad-shRNA-SOCS1 比较F=260.29,P<0.05,差异有统计学意义,Ad-shRNA-SOCS1与Ad-shRNA-mSOCS1比较P=277.83,P<0.05,差异有统计学意义。两因素析因分析在不同感染和比率条件下,CTL反应结果:（1）不同感染条件下[DCs、DCs-Ad-shRNA-mSOCS1（E7.49-57）、DCs-Ad-shRNA-SOCS1（E7.49-57）、DCs-Ad-shRNA-SOCS1（HPV16mE7）],CTL 反应效果不同,差异具有显著统计学意义（F感染分组=182.906,P<0.01）;（2）不同比率条件下（10:1、50:1、100:1）,CTL反应效果不同,差异具有显著统计学意义（F比率分组=787.213,P<0.01）;（3）不同感染和比率条件具有交互作用（F感染*比率=203.101,P<0.01）,在 DCs-Ad-shRNA-SOCS1（HPV16mE7）感染和 100:1 比率条件下,CTL反应效果最好。进一步分析各因素的单独效应:（1）10:1比例:DCs-Ad-shRNA-SOCS1（HPV16mE7）与其他各组比较,P<0.05,差异有统计学意义;其他各组比较,P>0.05,差异无统计学意义;（2）50:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义;（3）100:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。两因素析因分析在不同感染和比率条件下,上清液中IFN-γ水平:（1）不同感染条件下（PBS、DCs、DCs-Ad-shRNA-mSOCS1、DCs-Ad-shRNA-SOCS1）,IFN-γ水平差异具有显著统计学意义（F感染分组=475.139,P<0.01）;（2）不同比率条件下（10:1、40:1、100:1）,IFN-γ水平差异具有显著统计学意义（F感染分组=333.168,P<0.01）;（3）不同感染和比率条件具有交互作用（F感染*比率=32.236,P<0.01）,在 DCs-Ad-shRNA-SOCS1 感染和 100:1 比率条件下,IFN-γ水平最高。进一步分析各因素的单独效应:（1）10:1比例:DCs与DCs-Ad-shRNA-mSOCS1比较,P>0.05,差异无统计学意义,其他组比较P<0.05,差异有统计学意义;（2）40:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义;（3）100:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。不同DCs疫苗治疗肿瘤的效果显示,PBS对照组小鼠肿瘤生长较快,而DCs-Ad-shRNA-mSOCS1组和DCs-Ad-shRNA-SOCS1实验组可有效抑制肿瘤生长,且DCs-Ad-shRNA-SOCS1的作用更明显,显示良好的肿瘤治疗效果,同时没有观察到明显毒副作用。siSOCS1沉默后的DCs细胞在LPS刺激（siSOCS1 DCs + LPS）作用下,CD40,CD83,CD80,CD86和MHC-I分子的表达水平与对照组（DCs、siSOCS1 + DCs、simSOCS1DCs+LPS）比较,具有一定程度的升高。SOCS1沉默后的DCs对CIKs的影响研究中,两因素析因分析在不同感染和刺激条件下,共培养上清液中IL-6,IL-12p40,IL-12p70和IL-1 β水平:（1）不同感染条件下（空白DCs、Ad-shRNA-mSOCS1、Ad-shRNA-SOCS1）,IL-6、IL-12p40、IL-12（?）和IL-1β水平差异具有显著统计学意义（IL-6:F感染分组=1223.158,P<0.01;IL-12p40:F感染分组=1894.263,P<0.01;IL-12p70:F感染分组=3881.274,P<0.01;IL-1β:F感染分组=3528.552,P<0.01）;（2）不同刺激条件下（PBS、LPS、CpG、PolyI:C）,IL-6 IL-12p40,IL-12p70和IL-1 β水平差异具有显著统计学意义（IL-6:F刺激分组=313.500,P<0.01;IL-12p40:F刺激分组=348.197,P<0.01;IL-12p70:F刺激分组=796.722,P<0.01;IL-1β:F刺激分组=804.453,P<0.01）。不同刺激和感染条件具有交互作用,在LPS刺激和Ad-shRNA-SOCS1感染条件下,IL-6、IL-12p40、IL-12p70 和 IL-1β水平最高（IL-6:F刺激*感染=176.003,P<0.01;IL-12p40:F刺激*感染=188.454,P<0.01;IL-12p70:F刺激*感染=612.579,P<0.01;IL-1 β:F刺激*感染=502.899,P<0.01）。进一步分析各因素的单独效应:（1）空白PBS刺激组:空白 DCs、Ad-sh-SOCS1 及 Ad-sh-mSOCS1 感染后各上清液中 IL-6,IL-12p40、IL-12p70和IL-1β水平变化不明显,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（2）Ad-sh-SOCS1 感染后,经 LPS、CpG 和 PolyI:C 刺激,与空白 DCs、Ad-sh-mSOCS1感染后比较,上清液中的IL-6、IL-12p40、IL-12p70和IL-1β水平明显升高,差异具有显著统计学意义（P<0.01）。（3）空白DCs和Ad-sh-mSOCS1感染后经 LPS、CpG和 PolyI:C 刺激,上清中的 IL-6、IL-12p40、IL-12p70 和 IL-1β维持低浓度水平,与PBS组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。两因素析因分析在不同感染和比率条件下,DCs-CIKs对TC-1的裂解效应:（1）不同感染条件下[DCs+CIKs、siSOCS1 DCs+E7.49-57+CIKs+anti-IL-12、msiSOCSI DCs+E7.49-57 +CIKs、siSOCS1 DCs+E7.49-57+CIKs],CTL 反应效果不同,差异具有显著统计学意义（F感染分组=39.369,P<）.01);（2）不同比率条件下（11:1、33:1、50:1）,CTL反应效果不同,差异具有显著统计学意义（F比率分组=36.567,P<0.01）;（3）不同感染和比率条件具有交互作用（F感染*比率=3.235,P<0.05）,在siSOCS1 DCs+E7.49-57+CIKs感染和50:1比率条件下,CTL反应效果最好。进一步分析各因素的单独效应:（1）10:1比例:DCs+CIKs与其他三组比较P<0.05,差异有统计学意义;其他各组间比较,P>0.05,差异无统计学意义;（2）33:1 比例:msiSOCS1 DCs +E7.49-57 +CIKs 与 siSOCS1 DCs +E7.49-57+CIKs+anti-IL-12比较,P>0.05,差异无统计学意义;其他各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。（3）50:1比例:siSOCS1 DCs+7.49-54+CIKs与其他三组比较,P<0.01,差异有统计学意义;其他各组比较,P>0.05,差异无统计学意义。DCs-CIKs共培养时抗IL-12抗体能减弱CIKs对TC-1的杀伤活性。结论:1.在本研究中,我们采用健康人静脉血和小鼠骨髓,在细胞因子GM-CSF和IL-4诱导下成功培养了 DCs,在刺激剂LPS作用下,DCs从不成熟转变成成熟的表型。PBMCs和小鼠脾细胞在IFN-γ、IL-1 α、IL-2和抗CD3抗体诱导下形成CIKs的异质的细胞群体,包括CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+等。2.我们用组成式表达HPV16E6E7的小鼠TC-1（2×106）接种C57BL/C小鼠的皮下,成功制备宫颈癌的动物模型。3.我们成功构建了能在原核生物E:coli表达的HPV16mE7重组质粒,表达的mE7仍保留了 HPV16E7的免疫原性,可以作为疫苗抗原。4.成功构建重组腺病毒Ad-sh-SOCS1和Ad-sh-mSOCS1,证明了它们能够感染B16和DCs,并能沉默SOCS1。Ad-sh-SOCS1沉默和mE7脉冲的DCs疫苗对接种的TC-1细胞具有显著抑制作用,表明SOCS1沉默能强化DCs疫苗的抗肿瘤免疫效果。Ad-sh-SOCS1重组腺病毒也可以用于抗肿瘤治疗和抗病毒作用。5.炎症细胞因子IL-12在SOCS1沉默的DCs和CIKs的相互作用中起重要作用,是SOCS1沉默DCs加强CIKs的杀伤活性重要机制。