目的:Eph B2是酪氨酸蛋白激酶受体家族的成员之一,在皮肤鳞癌细胞中特异性高表达,可通过调控细胞凋亡、迁移、侵袭相关基因的表达,促进皮肤癌细胞的增殖和转移,是皮肤侵袭性肿瘤的潜在治疗靶点。本研究以Eph B2为靶蛋白,利用高通量虚拟筛选和计算机模拟分子对接技术从化合物数据库中筛选Eph B2潜在的小分子抑制剂,结合细胞实验和动物实验验证筛选出的小分子化合物对皮肤鳞状细胞癌的细胞毒性以及对动物的实际治疗效果,以期为新的抗皮肤鳞状细胞癌药物的开发奠定理论基础。方法:1.高通量虚拟筛选:从PDB数据库中确定Eph B2蛋白的三维结构,利用薛定谔对接工具优化其三维结构,预测其配体结合位点,高通量虚拟筛选结合分子对接技术筛选结合能较低、打分较高的小分子化合物;筛选出的小分子化合物的生物活性通过诱导契合对接进行预测;2.细胞实验:采用MTT法检测筛选出的小分子化合物对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞、SCL-1细胞和人永生化表皮细胞（Ha Ca T）的毒性作用;采用流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell小室实验检测筛选出的小分子化合物对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡、周期、迁移能力及侵袭能力的影响;采用RT-PCR与Western blot法检测小分子化合物对细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2、上皮间质转化标志物E-cadherin与Vimentin蛋白和基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9m RNA及蛋白表达的影响;3.动物实验:首先用人皮肤鳞状细胞癌A431细胞建立裸鼠移植瘤模型,将这些移植瘤模型采用随机分配原则,分空白对照组、DMSO组及筛选的两种药物治疗组;观察并记录裸鼠状态和移植瘤生长情况,计算抑瘤率。选用HE染色观察筛选出的小分子化合物对裸鼠移植瘤组织以及心、肝、脾、肺和肾等脏器的病理学影响;采用Western blot方法检测移植瘤组织中转移相关蛋白的表达;采用RT-PCR法检测移植瘤组织中转移相关蛋白m RNA的表达。结果:1.以Eph B2为靶蛋白,利用高通量虚拟筛选和分子对接从化合物数据库Spaces中筛选出了50个对接结果较好的小分子化合物;诱导契合对接结合实验MTT从中筛选出生物活性较好的两个小分子化合物AA-504/20999031（Kaempferitrin,KM）和AA-466/21162055（Aloe-emodin,AE）,并作为细胞和动物实验的干预药物;2.小分子化合物AE和KM能抑制A431细胞和SCL-1细胞的增殖;可以诱导A431细胞和SCL-1细胞发生凋亡;可以抑制两种皮肤鳞癌细胞的迁移和侵袭能力,并改变它们的细胞周期;3.RT-PCR和Western blot结果表明,AE和KM作用A431细胞和SCL-1细胞后,能抑制Eph B2、Bcl-2、Vimentin、MMP-2以及MMP-9的表达,促进Bax、Caspase-3和E-cadherin的表达;4.动物实验结果表明,成功建立了A431细胞裸鼠移植瘤模型,AE和KM干预能抑制裸鼠移植瘤的生长,其抑瘤率分别为23.23%和28.13%;移植瘤HE染色结果进一步证实AE和KM干预能减缓移植瘤的生长和改善其病理变化;裸鼠脏器HE染色结果表明AE和KM对裸鼠无明显的毒性作用;5.RT-PCR和Western blot结果表明,AE和KM治疗后,移植瘤组织中Bcl-2、Eph B2、Vimentin、MMP-2和MMP-9 m RNA表达下降,Caspase-3、Bax和Ecadherin m RNA表达上升。结论:1.利用高通量虚拟筛选和分子对接技术从中筛选出了2个打分较高的小分子化合物;结合细胞实验和动物实验证实这2个小分子化合物具有明显抗皮肤鳞状细胞癌作用;说明基于靶蛋白-配体的分子对接筛选出的小分子与其实际抗皮肤鳞状细胞癌的效果基本一致;2.AE和KM能通过促进Bax、Caspase-3和E-cadherin m RNA和蛋白表达,抑制Eph B2、Bcl-2、Vimentin、MMP-2以及MMP-9 m RNA和蛋白的表达,抑制皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭;3.AE和KM能抑制A431裸鼠移植瘤的生长,这可能是与其下调移植瘤组织中Bcl-2、Eph B2、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达,上调Caspase-3、Bax和E-cadherin表达相关。