足细胞是位于肾小球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)外侧的终末分化期细胞。它是蛋白尿漏出的最后一道屏障，所以足细胞损伤可以产生蛋白尿[1]。在许多人类及动物肾小球疾病模型中已证实足细胞的损伤，高血压肾损伤就是其中之一。　　 作为足细胞和GBM之间的重要黏附分子，整合素α3β1的减少是蛋白尿产生的重要原因之一。整合素α3β1是一类细胞表面的糖蛋白，它是由α与β两种亚基通过非共价键构成，其中α亚基相对β亚基大[5]。在不同的外界刺激作用下，整合素α3β1结合不同的配体，包括层黏连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin)和胶原(collagen)，从而向细胞内传导不同的信号[6]。这是以细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、整合素α3β1和骨架蛋白组成的焦点黏附物为结构基础实现的。许多信号蛋白通过与焦点黏附物结合，在整合素介导的信号转导中发挥作用。局部黏附激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)就是细胞内一个重要的信号蛋白，它是一个非受体型酪氨酸激酶。酪氨酸397位点是FAK的重要磷酸化位点，它是通过一些激活蛋白（如整合素的胞浆端等）取代FERM区域的位置从而破坏了FERM和激酶区之间的自身抑制作用实现的。已有报道，磷酸化的FAK在足细胞损伤过程中明显增加，而且抑制FAK的激活可以减少蛋白尿的产生和足细胞的融合[7]。在高血压心力衰竭动物模型中，人们发现FAK和磷酸化FAK的表达明显增加并表现出明显的核内聚集[8，9]。但是这些发现都是在慢性疾病中或者制造动物模型后很长时间观察到的。而在异常血流动力学变化早期肾小球整合素β1以及FAK的瞬间表达变化还未见报道。　　 血流动力学因素对小鼠肾脏结构和功能等方面具有重要的影响[10-12]，且其影响瞬息万变，需要应用一种能瞬间捕获组织细胞原位变化的技术来反映活体内真实的病理生理状态。使用传统的固定组织方法是难以实现的[13]。而采用“活体冷冻技术”(in vivo cryotechnique，IVCT)结合冷冻置换方法能使活体小鼠肾脏内所有生物进程被即刻停止。我们课题组已成功应用IVCT观察到异常血流动力学条件下血清蛋白在肾小球中的分布变化[14]。以上研究充分说明活IVCT是一项观察异常血流动力学条件下肾小球结构和功能变化的可靠方法。　　 本研究应用IVCT结合免疫组化、共聚焦显微镜、免疫电镜、western blot等技术观察异常血流动力学条件下整合素β1和FAK的变化，为进一步阐明蛋白尿的产生机制提供依据。　　 目的：　　 本研究旨在探讨不同血流动力学条件下足细胞基底膜黏附蛋白整合素β1、相关信号分子FAK的分布变化，为进一步阐明蛋白尿的产生机制，寻求新的蛋白尿的治疗方法提供依据。　　 方法：　　 1.实验动物:昆明小鼠20只，体重20-30克，雌雄不限，由中国医科大学实验动物部提供。　　 2.实验分组:　　 (1)应用IVCT固定的正常血流组　　 (2)应用IVCT固定的急性高血压组（结扎小鼠左侧肾动脉下的腹主动脉10分钟）　　 (3)应用IVCT固定的停止血流组（腹腔一次性注入超剂量戊巴比妥钠致使心脏骤停，导致血液循环停止）　　 (4)侵润固定正常血流组及直接切除快速冷冻组（对照组）　　 3.应用HE染色、免疫组化DAB显色、间接免疫荧光及免疫电镜技术观察肾小球的结构变化以及整合素β1和FAK的动态变化，应用western blot技术对上述蛋白进行定量分析，同时应用免疫组化DAB显色法观察酪氨酸397磷酸化FAK(pTyr397FAK)的变化。　　 结果：　　 1.不同血流动力学条件下肾小球的结构变化:在正常血流动力学条件下，肾小囊呈裂隙状，毛细血管较光滑饱满;而在急性高血压条件下，肾小囊和肾小管变得更加扩张;相反，在停止血流组以及浸润固定正常血流的条件下，肾小球毛细血管襻闭塞。另外，在活体冷冻固定组的肾小球毛细血管内均可见不同数量的红细胞存在，而在侵润固定组几乎未见红细胞存在。　　 2.足细胞整合素β1、FAK与pTyr397FAK在肾小球的分布变化:正常血流条件下，整合素β1沿着基底膜呈线性分布，分布均匀;FAK和pTyr397FAK在足细胞的胞浆和胞核中均匀分布。在急性高血压条件下，三者的表达均明显减少，整合素β1呈断续分布，部分染色缺失;在异常血流组和浸润固定组FAK和pTyr397FAK的表达进一步减少并出现不均匀表达。而整合素β1在浸润固定组较活体冷冻组的表达明显增多。共聚焦显微镜进一步证明了整合素β1和FAK在足细胞的分布，同时可以看到两者共同表达位点在异常血流动力学条件下减少且不均匀。　　 3.急性高血压条件下足细胞超微结构分析及整合素β1、FAK的分布和表达变化:急性高血压条件下，足细胞足突出现不同程度的融合，并且出现整合素β1从足突侧部向基底部，FAK从胞浆向胞核的移位聚集现象。　　 4.不同血流动力学条件下整合素β1、FAK的定量分析:在急性高血压、停止血流和直接切除组上述蛋白表达均明显减少(P＜0.05)。而且FAK在异常血流动力学条件下表现出明显核内聚集现象，其中直接切除组的变化最大。　　 结论：　　 1.急性高血压能够造成足细胞损伤，致使足突融合，整合素β1和FAK的异位表达。　　 2.异常血流动力学条件可导致整合素β1、FAK蛋白在肾脏的表达减少。　　 3.整合素β1、FAK、pTyr397FAK的分布和表达变化，在调节异常血流动力学条件下的足细胞功能中起着非常重要的作用。　　 4.“活体冷冻技术”能更好的保存肾小球结构及生物学成分。异常的血流动力学可以导致肾小球结构的破坏。