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目的:
1.从SwissProt蛋白数据库获得EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的全长氨基酸序列,利用生物信息软件对EBV LMP2中的HLA-A*0201限制性CD8+细胞毒特异T细胞(cytotoxicity T cell,CTL)表位进行预测。
2.筛选以SYFPEITHI预测的结果为基础,结合NetCTL、HLA-Bind和Rankpep预测的结果,兼顾本实验室已经研究的多表位片段,综合分析后,筛选出此片段内未报道过的可能性CTL表位肽。
3.鉴定利用和T2细胞结合的亲和力实验、稳定实验；利用HLA-A2个体外周血PBMC作为效应细胞,进行体外细胞毒实验乳酸脱氢酶(LDH)释放法、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因了染色(Intracellular Cytokine Staining,ICS)法对筛选的CTL表位进行了鉴定,获得了2条具有免疫效应的EBV LMP2 CTL的优势表位,为EBV分了疫苗的设计奠定了基础。
方法:
1.EBV LMP2 HLA-A*0201限制性CTL表位的预测和筛选
从SwissProt蛋白数据库获得EBV LMP2全长氨皋酸序列,以Syfpeithi、NetCTL、HLA-Bind、Rankpep等四种在线乍物信息软件预测EBV LMP2中的HLA-A*0201限制性CTL表位,综合分析筛选出EBV LMP2中可能存在的CTL表位肽。
2.表位肽的合成
西安华辰牛物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案进行合成,采用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化并进行质谱法(MS)分析鉴定。
3.CTL表位肽的鉴定
(1)抗原肽与HLA-A*0201分予亲和稳定实验:对上述筛选出的CTL表位肽鉴定其与HLA-A*0201分子间的亲和稳定性,本实验利用内源性抗原加工处理能力缺失(TAP缺陷)的T2细胞,该细胞表面HLA-A*0201分了极不稳定,但当抗原肽与之结合后,MHC分了稳定性增加,肽与MHC分了结合力越强,则肽-MHC复合体稳定性越强,从而测定表位肽的亲和稳定性；
(2)HLA分型:采用葡聚糖-泛影葡酸(Ficoll)等密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),利用FITC标记的HLA-A*0201单克隆抗体进行直接免疫荧光检测,筛选出HLA-A*0201阳性个体的PBMC；
(3)体外细胞毒实验乳酸脱氢酶(LDH)释放法:以HLA-A*0201阳性个体PBMC经体外刺激培养后作为效应细胞,而以负载CTL表位的T2细胞作为靶细胞,利用LDH法检测效靶比(E:F)为10:1、20:1、40:1时各CTL表位肽诱导的特异性CTL的细胞毒杀伤活性；
(4)ELISPOT和细胞内细胞因子染色(ICS)法:采用人IFN-γ ELISPOT试剂龠对经CTL表位刺激后的特异性CTL频数即斑点形成细胞(spot forming cell,SFC)数目进行检测,使用德国BIO-SYS公司的Bioreader4000型自动斑点分析仪进行自动拍照及斑点计数；而ICS则是通过免疫荧光标记的单抗检测各CTL表位肽刺激后其特异性CTL细胞分泌的IFN-r水平,采用流式细胞仪检测特异性CTL的数目,以此来鉴定EBVLMP2的HLA-A*0201限制性CTL表位。
结果:
1.CTL表位预测结果及初步筛洗
根据Syfpeithi预测选择其分值较高的表位肽,同时结合NetCTL、HLA-Bind、Rankpep等在线软件预测的结果、国内外已经报道的CTL表位和本实验室后续实验的需要进行综合分析,筛选出ALLAAAGGL(211～219)、VFMCLGGLL(423～431)、AAGGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)5条可能性的CTL表位肽,分别命名为EBp1、EBp7、EBp8、EBp9、EBp10。同时以HLA错配多肽HLA-A*2402限制性的CTL表位TYGPVFMCL(419～427)作为阴性对照肽,已报道证实的HLA-A*0201限制性的CTL表位LLWTLVVLL(329～337)作为阳性对照肽,分别命名为EBp11和EBp12。
2.CTL表位肽的合成
由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案进行合成,经高效液相色谱法HPLC纯化后,获得纯度高于95％的九肽产物,质谱法MS鉴定氨基酸序列,测定分了量所得测定值与理论值相符合。高纯度的合成肽为表位筛选与鉴定奠定了前提和基础
3.CTL表位的鉴定
(1)肽亲和稳定实验检测结果显示,表位肽ALLAAAGGL(211～219)、AAGGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)、VFMCLGGLL(423～431)与T2细胞上的HLA-A*0201分了亲和力(FI)分别为3.84、3.65、2.79、3.56、2.83,阳性肽LLWTLVVLL(329～337)与阴性肽TYGPVFMCL(419～427)的亲和力(FI)则分别为5.00和1.58；而稳定性(DC50)分别是>8h、4～6h、<2h、2-4h、<2h,阳性肽LLWTLVVLL(329～337)与阴性肽TYGPVFMCL(419～427)的稳定性(DC50)则分别为>8h和<2h。提示,ALLAAAGGL(211～219)和AAGGLQGIY(215～223)即EBp1和EBp8与T2细胞上的HLA-A0201分子有较高的亲和力与稳定性。
(2)LDH释放试验的结果显示,E:T=40:1及20:1时,EBpl和EBp8诱导的CTL对负载EBp1的T2细胞和负载EBp8的T2细胞的杀伤率分别为(37.16±2.28)％、(22.35±2.55)％及(27.92±2.21)％、(18.23±1.89)％,明显高于阴性对照(10.86±1.49)％、(10.08±2.02)％,(FEBp1=296.056,P<0.05:FEBp1=107.874,P<0.05和FEBp1=255.747,P<0.05:FEBp8=88.201,P<0.05),而与阳性对照(45.50±1.60)％、(24.68±1.04)％相比没有显著性差异(P>0.05),因此EBpl和EBp8表现为抗原特异性、MHC限制性杀伤,而其余肽未能诱导出特异性的CTL。
(3)ELISPOT法检测针对ALLAAAGGL(211～219)、从GGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)、VFMCLGGLL(423～431)五条表位肽刺激产生IFN-r特异性CTL频数均数分别为306±37、238±24、14±3、6±2、8±2(SFC*/105),阳性肽与阴性肽的特异性CTL频数均数分别为324±29和4±2(SFC*/105)。结果显示ALLAAAGGL(211～219)和AAGGLQGIY(215～223)形成的斑点数与阳性肽无显著差异(FEBp1=30.859,FEBp8=45.683,P>0.05),明显高于阴性对照(FEBp1=433.504,FEBp8=363.289,P<0.05)。而其余肽对HLA-A2细胞捉呈的抗原能发生应答而活化,所形成的斑点数明显少于阳性肽(P<0.05),与阴性照无显著差异(P>0.05)。
(4)通过流式细胞仪分析IFN-γ+CD8+双阳性细胞数的变化来判定所合成的肽能否刺激PBMC增殖,进而确定这些肽在人PBMC中诱导抗原特异性CTL的能力,以鉴定其是否为特异性CTL表位。结果表明,经ALLAAAGGL(211～219)和AAGGLQGIY(215～223)刺激后,IFN-γ+CD8+双阳性细胞数分别为阴性肽刺激组的4.8倍及3.4倍,而其它肽组与阴性对照组比无明显区别。
结论:
1.经Syfpeithi、NetCTL、HLA-Bind、Rankpep等四种在线软件对EBV LMP2中的HLA-A*0201限制性CTL表位预测,筛选了5个可能的EBV LMP2 HLA-A*0201限制性CTL表位,即ALLAAAGGL(211～219)、AAGGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)、VFMCLGGLL(423～431),并委托进行CTL多肽合成。
2.经肽亲和稳定实验、LDH释放法、ELISPOT和ICS等方法检测,ALLAAAGGL(211-219)、AAGGLQGIY(215～223)(EBp1、EBp8)2条CTL表位肽显示具有免疫效应,为EBV LMP2 CTL的优势表位,为EBV分子疫苗的设计奠定了基础。