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目的:EPS(EGFR Pathway Substrate)蛋白是一类新型膜转运调控蛋白,广泛参与蛋白分子的转运,并与肿瘤的发生发展密切相关。EPS调控EGFR转运,进而维持EGFR稳定性及其信号通路活性;EPS高表达的肿瘤患者易发生远处转移,预后较差。E-Cad(E-Cadherin)是细胞膜表面黏附分子,是上皮细胞保持上皮功能与表型的关键分子与标志物,E-Cad表达丧失是上皮来源肿瘤EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)的关键事件,研究表明,EGFR可调控E-Cad的表达。基于以上的研究背景,本课题试图探究EPS是否可能通过调控EGFR调节胞内E-Cad的蛋白水平,进而介导肿瘤细胞的EMT过程,为肿瘤的防治提供新的靶标和思路。方法:1.通过Western blot技术检测细胞系中EPS、EGFR、E-Cad的表达水平,以选择适合后续研究的细胞模型。2.利用Crispr/Cas9基因敲除技术建立Hela、A549的EPS敲除细胞系。3.Hela中EPS过表达、敲除以及A549中EPS过表达、敲除对细胞迁移和EGFR、E-Cad表达的影响。4.通过应用特异性抑制剂对基因转录、蛋白媒体降解及溶酶体降解进行分别作用,辨别E-Cad表达水平变化的分子调控机制。5.HP(Hoechst-PI)染色与成像技术检测各种抑制剂对Hela、A549细胞的最大安全浓度。6.应用Western blot技术检测Hela、A549中EPS与EGFR、E-Cad的表达关系及各种抑制剂的有效浓度。7.EPS敲除A549细胞对EGFR、E-Cad表达的影响。1)Western blot检测EGF短时间刺激下EPS敲除对EGFR磷酸化水平影响,EGF长时间作用EPS敲除对调控EGFR降解影响及E-Cad表达变化。2)Western blot检测蛋白酶体抑制剂MG132预处理后EGF刺激及EPS敲除对EGFR降解影响以及E-Cad表达变化。结果:1.Western blot检测结果显示,不同肿瘤细胞系EPS、EGFR、E-Cad表达水平不一,本研究选择EPS,EGFR,E-Cad均适度有表达的Hela、A549作为实验细胞模型。2.Crispr/Cas9基因敲除技术成功构建Hela-Cas9-GFP-EPS/KO及A549-Cas9-EPS/KO细胞系。3.通过愈合实验显示EPS过表达促进细胞迁移,EPS敲除抑制细胞迁移;Western blot检测结果显示Hela、A549中EPS敲除后EGFR降低,E-Cad表达上调,EPS对EGFR和E-Cad表达水平的影响在Hela细胞中较弱,A549中较强。4.确定了各种抑制剂的最大安全浓度与最低有效浓度:1)Hela细胞用抑制剂分别处理12小时(h)和24小时(h),HP(Hoechst-PI)染色检测抑制剂CHX、MG132、CQ的最大安全浓度,其中CHX、MG132、CQ最大浓度取三次结果最小值为最大安全浓度:Hela-DMSO-SCmax-12 h =30ul/ml,Hela-DMSO-SCmax-24 h =10ul/ml;Hela-CHX-SCmax-12 h =30ug/ml,Hela-CHX-SCmax-24 h =9ug/ml;Hela-MG132-SCmax-12h=15ug/ml,Hela-MG132-SCmax-24 h =5ugml;Hela-CQ-SCmax-12 h =9ug/ml,Hela-CQ-SCmax-24 h =1ug/ml;2)根据抑制剂处理12h的Western blot检测结果,我们选择CHX有效浓度为9ug/ml,MG132有效浓度为1.5ug/ml,CQ有效浓度为3ug/ml,分别约为最大安全浓度的1/3、1/10和1/3,以此为安全有效浓度用于后续功能实验3)Hela中EGFR、E-Cad降解速率明显快于A549,因此选择A549作为转录调控细胞研究模型。5.EPS敲除后,EGF对EGFR磷酸化激活明显减弱,EGFR降解减少,E-Cad表达升高,AG1478抑制EGFR磷酸化后,EGFR降解减少,提示EPS可促进EGFR信号通路,并调控E-Cad表达。结论:1.EPS可能通过调控EGFR稳定性提高受体的表达水平。2.EPS通过调控EGFR的表达水平影响E-Cad表达。3.EPS对E-Cad的间接调控与EGFR的磷酸化活化相关。4.EPS可能通过对EGFR的转运调控和对E-Cad的间接调控影响肿瘤细胞迁移及EMT。