Liguzinediol,化学名为2,5-二羟甲基-3,6-二甲基吡嗪,是川芎嗪经结构修饰后得到的水溶性单体化合物。其作用靶点为心肌细胞内肌浆网蛋白SR Ca2+ATP酶,具有明确的正性肌力作用,在大剂量下未见心律失常副作用。课题组前期已经对大鼠及比格犬的体内药代动力学、雌雄间差异及其代谢产物鉴定进行了系统研究,发现liguzinediol的半衰期较短,且在雌雄大鼠体内有较明显的差异;产生的代谢产物颇多,包括氧化产物、葡萄糖醛酸结合产物、半胱氨酸及乙酰半胱氨酸结合产物等,这提示了可能通过肝药酶代谢。本文首次利用探针药物法研究liguzinediol对大鼠及人肝微粒体P450酶活性的影响,并选择CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4六种酶亚型建立大鼠及人肝微粒体中的体外代谢孵育系统和LC-MS/MS的测定法;同时进一步对liguzinediol在大鼠、犬、猴等多种属动物和人中的代谢产物进行研究,并比较不同种属间的差异,为临床前安全性评价合适动物的选择以及临床安全用药提供有力依据。本文主要开展以下几方面的研究工作。一、大鼠肝微粒体单底物体外探针法研究liguzinediol对CYP450酶亚型的影响为了考察liguzinediol对代谢酶的影响,本章以大鼠肝微粒体为模型,选用非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑分别作为CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的特异性底物,建立单底物考察系统,采用灵敏、快速的LC-MS/MS测定方法研究liguzinediol对CYP450酶活性的影响。为了准确评价各特征探药在大鼠肝微粒体中经P450酶介导代谢的反应动力学特征,分别对蛋白浓度和孵育时间进行了优化,以探针药物代谢产物的生成量与蛋白浓度或孵育时间的线性关系确定孵育条件,然后测定各探针底物的米氏常数Km,最终确立体系的各项条件,借助LC-MS/MS依次测定不同浓度liguzinediol对特异性探针药物代谢产物量的影响,通过抑制率来表征liguzinediol的体外抑制作用。采用 Shim-pack XR-ODS 色谱柱(50mm×2.0mm,2.2μm),柱温35℃,流速 0.3mL/min,以0.2%甲酸水和乙腈进行梯度洗脱。质谱采用ESI离子源,分别对各个特异性探针底物代谢产物进行检测。各方法学考察结果表明,在检测浓度范围内呈良好的线性关系,精密度、准确度的RSD均小于15%,符合生物样品的分析要求。在7个浓度水平下,liguzinediol对大鼠各CYP450酶亚型探针底物代谢速率的抑制率小于15%,表明在大鼠肝微粒体的单个探针底物研究中,liguzinediol分别由CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4六种酶亚型介导的单底物代谢抑制作用发生的可能性很小或者基本不存在。二、人肝微粒体单底物体外探针法研究liguzinediol对CYP450酶亚型的影响选用人肝微粒体建立了 6种P450酶亚型(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4)体外代谢模型,依次选择非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗、咪达唑仑等特异性探针底物,在辅助因子以及一定的时间作用下反应,借助于LC-MS/MS方法测定生成的特定产物量,即对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、去甲右美沙芬、6-羟基氯唑沙宗、1’-羟基咪达唑仑的生成速率,表征相应P450同工酶的活性大小,通过抑制率来表征liguzinediol的体外抑制作用。同样分别对蛋白浓度和孵育时间进行了优化,以探针药物代谢产物的生成量与蛋白浓度或孵育时间的线性关系确定孵育条件,然后测定各探针底物的米氏常数Km,最终确立体系的各项条件。在7个浓度梯度下,发现除CYP2C9的特异性底物甲苯磺丁脲外,不同浓度liguzinediol对其余五种酶亚型(CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4)的抑制作用均小于15%,表明在人肝微粒体的单个探针底物研究中,liguzinediol对人的5种酶亚型基本不存在抑制作用,但是对CYP2C9有微弱的抑制作用,暗示liguzinediol由此五种CYP450酶亚型介导的代谢抑制作用发生的可能性很小或者基本不存在,而当与CYP2C9介导的药物联用时需适当的注意。将人与大鼠的孵育体系和酶的抑制作用比较,liguzinediol对人肝CYP2C9的微弱的抑制作用,对大鼠肝药酶和人肝的其余五种酶亚型均无显著抑制作用,为后期临床安全用药提供实验依据。三、大鼠肝微粒体“N-in-One”体外探针法研究liguzinediol对P450酶亚型的影响前两部分用单底物探针法研究了 liguzinediol对CYP450酶的影响,均属于低通量检测方式。为了快速评价药物对CYP450酶的影响,建立了大鼠肝微粒体中同时测定6种探针底物代谢物的高通量检测方法,即“N-in-One”体外探针法,经方法学考察,符合生物样本检测的要求。通过测定探针底物代谢产物的生成速率,将其与空白对照组的生成速率相比来计算抑制率,发现不同浓度liguzinediol对大鼠各CYP450酶亚型的抑制作用均小于15%,对比“N-in-One”系统与单底物系统,两种系统得到的结果一致,表明liguzinediol对6种酶亚型基本不存在抑制作用。四、人肝微粒体“N-in-One”体外探针法研究liguzinediol对P450酶亚型的影响建立人肝微粒体中同时测定6种探针底物代谢物的高通量检测方法,即“N-in-One”体外探针法,经方法学考察,符合生物样本检测的要求。快速评价liguzinediol对人肝微粒体CYP450酶的影响。结果表明不同浓度liguzinediol对人各CYP450酶亚型的抑制作用均小于15%,对比“N-in-One”系统与单底物系统,两者有一定的差异,在单底物系统中,liguzinediol对由CYP2C9介导的代谢有微弱的抑制作用,但在“N-in-One”系统中却未发现明显的抑制作用,可能由于“N-in-One”系统是多个底物同时作用,存在其它底物的相关影响。综上所述,liguzinediol对5种酶亚型基本不存在抑制作用,暗示在人体内,liguzinediol由此五种CYP450酶亚型介导的代谢抑制作用发生的可能性很小或者基本不存在,但当与CYP2C9介导的药物同时使用时,需要关注人体的用药情况。五、Liguzinediol在不同种属肝微粒体中代谢产物的比较研究前期对liguzinediol在大鼠和犬体内的排泄和处置研究,发现在尿液、胆汁和粪便中出现多个代谢产物,在大鼠和犬排泄物中含有氧化产物、葡萄糖醛酸结合物、半胱氨酸结合物及乙酰半胱氨酸结合物等。Liguzinediol的代谢产物种类较多,但其药物代谢酶尚不明确,动物与人的代谢途径尚未见比较,本节建立了 liguzinediol及其体外代谢产物的LC-MS/MS检测方法,选择大鼠、犬、猴、人等多种属肝微粒体,以NADPH供氢进行氧化反应,以UDPGA为糖基供体进行葡萄糖醛酸结合反应,采用动态背景扣除和触发信息关联采集模式进行分析。结果发现liguzinediol在肝脏可发生Ⅰ相氧化代谢和Ⅱ相代谢葡萄糖醛酸结合,并且在大鼠、狗、猴、人肝微粒体温孵体系中均孵育有氧化产物和葡萄糖醛酸结合产物。表明liguzinediol在大鼠、犬和猴等动物的肝微粒体中的Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物与人肝微粒体基本一致,该研究结果可为liguzinediol临床前安全性评价的实验动物选择提供依据。前期大鼠药代动力学研究中发现胆汁中有谷胱甘肽结合物,犬药代动力学研究中发现尿液中有硫酸结合物,而且半胱氨酸结合物和乙酰半胱氨酸结合物均是特征性代谢产物,但通过普通的孵育却并不能得到,经查阅文献发现半胱氨酸及乙酰半胱氨酸结合物可能由谷胱甘肽结合物转变而来,本节建立了 liguzinediol及其谷胱甘肽结合产物的LC-MS/MS检测方法,采用肝细胞浆温孵法研究liguzinediol在大鼠、犬、猴、人等多种属肝细胞浆中的代谢产物,由PAPS作为供体提供硫酸根,以GSH作为捕获剂,脱去硫酸根结合谷胱甘肽,才能孵育得到谷胱甘肽结合物,再由其水解得到半胱氨酸及乙酰半胱氨酸结合物,进一步比较不同种属动物与人之间的代谢差异,为liguzinediol临床前研究的实验动物选择提供依据。