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豆豉纤溶酶（Dochi fibrinolytic enzyme,以下简称DCFE,E.C.3.4.21.7）是一种由中国传统发酵食品豆豉中分离出来的具有较高纤溶酶酶活的丝氨酸蛋白酶。它不但可直接溶解纤维蛋白,抑制血栓形成,而且具有抑制机体凝血,抗血小板聚集,增强纤溶等方面的功能。DCFE可由微生物发酵生产,安全性好,价格便宜,具有开发成新一代溶栓药和相关功能食品的潜力。 本论文主要研究内容:DCFE高产菌的选育;DCFE高产菌UγD8发酵条件优化;DCFE提取、分离和纯化;DCFE酶学性质的研究;DCFE溶栓和抗栓功效研究。通过上述研究,得到以下主要研究结果: 利用自行设计的DCFE产生菌筛选模型成功获得一株产DCFE酶活高达1,200IU/mL的菌株DC-S6。对该菌株进行物理(紫外线、60Co)、化学（硫酸二乙酯DES）诱变处理、纤维蛋白平板初筛、摇瓶复筛,得到突变株UγD8,其发酵液DCFE酶活在2,900IU/mL以上,比出发菌DC-S6提高了1.4倍。传代实验表明,DCFE高产菌UγD8在10代以内产酶能力基本没有下降,表明此菌遗传性状稳定。对UγD8的菌体形态、菌落形态与特征、菌种生理生化特性进行分析,初步推断该菌株属于芽孢杆菌属Bacillus sp.。用不同剂量UγD8发酵液给小鼠灌胃后,半数致死剂量大于80g/kg,说明Uγ/D8发酵生产的DCFE属于实际无毒生化制品。 DCFE高产菌UγD8的发酵条件优化结果表明:较适宜的碳源为蔗糖;最适氮源为豆浆,有机氮源优于无机氮源;较适宜的培养基初始pH7.0。采用正交实验得出最优培养基组成（g/L）:蔗糖20,纤维蛋白5,豆浆1000mL（蛋白质浓度40g/L）,KH2PO4·3H2O1,K2HPO4·3H2O 2.5,MgSO4·7H2O 5,CaCO3 4。采用优化后的培养基进行25L发酵罐发酵试验。种龄12h,接种量2%;装液量为10L,温度37℃,风量14L/min,发酵72h后DCFE酶活高达3,300IU/mL。 DCFE提取、分离和纯化方法的研究结果表明:发酵液经过65%硫酸铵沉淀、CM-Sepharose-FF离子交换色谱和Sephacryl S-200凝胶过滤色谱等步骤,得到DCFE纯酶,其回收率为3.7%,纯化倍数为35.5,比活达到10,898IU/mg。该纯酶SDS-PAGE凝胶电泳图谱为单一电泳带,由此推断DCFE没有亚基,以单体形式存在。SDS-PAGE凝胶电泳和Sephacryl S-200凝胶过滤测得DCFE的相对分子质量分别为31.0kDa和30.2kDa,进一步证实该酶为单体酶。 DCFE溶液稳定性研究结果表明:Ⅰ:该酶最适温度为50℃,最适pH为7.5～8.0。Ⅱ:环境pH8.0时酶活最稳定,说明DCFE是一种偏碱性蛋白酶。Ⅲ:37℃下保温1h,发酵液中残余酶活下降到93%,纯酶酶活下降到50%;50℃下保温1h,粗酶酶活仍有80%,而纯酶仅剩40%;60℃下保温1h,粗酶酶活仅剩5.8%,而纯酶酶活几乎完全丧