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目的:观察复方中药八子补肾胶囊对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠皮肤衰老的干预作用,探讨其作用机制。方法:将70只雄性C57小鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(M odel)、八子补肾胶囊低剂量组(LDBZ)、八子补肾胶囊高剂量组(HD BZ)、烟酰胺单核苷酸胶囊组(NMN)。Normal组颈背部皮下注射无菌注射水,其他各组颈背部皮下注射D-半乳糖溶液(100mg/kg/d)制备衰老小鼠模型,每天皮下注射1次,持续12周。从第7周开始,Normal组和Model组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液,LDBZ组、HDBZ组分别灌胃1g/kg/d、2g/kg/d八子补肾溶液,NMN组灌胃100mg/kg/d NMN溶液,每天灌胃1次,持续6周。给药结束进行抓力、转棒、悬挂实验后取材,收集小鼠血浆、皮肤、脾脏、胸腺、脑,并计算脾脏、脑、胸腺指数。多因子检测仪检测血浆和皮肤IL-1β、MMP-9、IL-10含量,进行HE染色、天狼猩红染色、间苯二酚碱性品红染色、甲苯胺蓝染色、β-半乳糖苷酶染色观察皮肤形态结构变化。免疫组织化学法检测皮肤p16、p53蛋白表达水平,免疫荧光法检测皮肤p16、Lgr5蛋白表达水平。结果:1.Normal组皮毛光滑发亮,活动正常,精神状态佳;Model组毛发色泽暗淡,局部变白脱落,活动减少,精神欠佳;LDBZ组和HDBZ组较Model组有明显改善,毛发浓密光亮,未见毛发脱毛变白,精神良好,活动灵活;NMN组未见明显毛发脱毛变白,活动如常,精神尚可。2.行为学实验显示,与Normal组比较,Model组悬挂时间、抓力、转棒停留时间均显著降低(P<0.01)。与Model组比较:LDBZ组和H DBZ组悬挂时间均显著升高(P<0.01)、抓力均显著升高(P<0.05,P<0.01);LDBZ组转棒停留时间无显著差异(P>0.05),HDBZ组转棒停留时间显著升高(P<0.01);NMN组抓力显著升高(P<0.01),悬挂时间和转棒停留时间均无显著差异(P>0.05)。3.脏器指数结果显示,与Normal组比较,Model组脾脏指数、胸腺指数和脑指数均显著降低(P<0.01)。与Model组比较:LDBZ组、HD BZ组和NMN组脾脏指数、胸腺指数均显著升高(P<0.01);LDBZ组、HDBZ组和NMN脑指数均显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。4.血浆多因子结果表明,与Normal组比较,Model组IL-1β、MMP-9水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。与Model组比较:LDBZ组IL-1β、MMP-9水平均无显著差异(P>0.05);HDBZ组IL-1β、MMP-9水平均显著降低(P<0.01);NMN组IL-1β、MMP-9水平均显著降低(P<0.01,P<0.05)。与Normal组比较,Model组IL-10水平显著降低(P<0.05)。与Model组比较:LDBZ组、HDBZ组IL-10水平均显著升高(P<0.01);NMN组IL-10水平无显著差异(P>0.05)。5.皮肤多因子结果显示,各组间IL-1β水平均无显著差异(P>0.05)。与Normal组比较,Model组MMP-9水平显著升高(P<0.01)。与Mode l组比较:LDBZ组、HDBZ组和NMN组MMP-9水平均显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。与Normal组比较,Model组IL-10水平显著降低(P<0.01)。与Model组比较:HDBZ组IL-10水平显著升高(P<0.01);LDBZ组和NMN组IL-10均无显著差异(P>0.05)。6.皮肤染色结果显示:Normal组表皮规则,厚度均一,胶原纤维束状整齐排列,弹力纤维呈清晰的紫色,卵圆形肥大细胞未见脱颗粒,表皮、真皮层β-半乳糖苷酶表达较少。Model组表皮不规则,厚薄不均,真皮层变薄,胶原纤维减少,部分发生断裂,弹力纤维减少,肥大细胞增多、脱颗粒明显,表皮层、毛囊处β-半乳糖苷酶表达升高。LDBZ组表皮较规则,真皮层厚度增加,胶原纤维、弹力纤维增多,肥大细胞减少,可见少量脱颗粒,β-半乳糖苷酶表达降低。HDBZ组表皮厚薄较均匀,真皮层未见明显增加,胶原纤维、弹力纤维增多,肥大细胞减少,未见肥大细胞脱颗粒,β-半乳糖苷酶表达降低。NMN组表皮层较规则,真皮层厚度有所增加,胶原纤维增、弹力纤维略有增多,肥大细胞数量减少,存在个别肥大细胞脱颗粒,表皮层β-半乳糖苷酶表达降低,毛囊处仍有较多β-半乳糖苷酶表达。7.皮肤免疫组化结果显示,与Normal组比较,Model组皮肤黄染增多,提示p16和p53表达均升高。LDBZ组和HDBZ组皮肤棕黄色阳性表达较Model组减少,表明p16和p53蛋白表达降低。NMN组皮肤可见棕黄色阳性表达,但较Model组减少。8.皮肤免疫荧光结果显示,Normal组p16、Lgr5蛋白在毛囊均有表达。与Normal组比较,Model组p16蛋白表达增加,Lgr5蛋白表达减少。与Model组比较:LDBZ组p16蛋白表达减少、毛球部Lgr5表达增加;HD BZ组p16蛋白表达减少,毛囊隆突外毛根鞘处Lgr5蛋白表达增加;NM N组p16蛋白表达减少,毛球部Lgr5蛋白表达增加。结论:1.本课题以气络学说为指导,提出皮肤衰老的根源为“肾精虚衰”,补肾填精是防治皮肤衰老的重要治法。建立D-半乳糖致衰小鼠模型,证实八子补肾胶囊可以改善衰老小鼠整体状态、改善运动能力,并提高脾脏、胸腺、脑指数。2.研究证实八子补肾胶囊可减少毛发脱落变白,增加真皮层厚度,提高皮肤胶原纤维和弹力纤维含量,降低β-半乳糖苷酶活性,明显改善皮肤衰老状态。3.八子补肾胶囊可下调血浆IL-1β、MMP-9水平,上调IL-10水平改善炎症状态。研究证实其可以减少肥大细胞脱颗粒的发生,降低皮肤MMP-9水平、提高IL-10水平,减轻皮肤炎症反应,通过下调p16、p53蛋白表达减缓细胞衰老,上调Lgr5蛋白表达促进毛囊干细胞增殖,多环节作用延缓皮肤衰老。