第一部分 单纯线粒体肌病临床表型-基因型特征研究背景线粒体由双层膜包被的细胞器,存在于人体的绝大多数细胞中,除了成熟的红细胞以外,每个细胞都含有数百个线粒体。线粒体的呼吸链由5个酶复合体组成,是细胞进行有氧代谢和氧化磷酸化的重要场所,线粒体通过呼吸链进行电子传递,在细胞能量产生、细胞内信号传导、细胞的生长、增殖、分化、衰老以及凋亡中发挥着重要作用。线粒体病是由线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）或线粒体相关核基因（nDNA）突变,引起的线粒体呼吸链氧化磷酸化障碍（oxidative phosphorylation,OXPHOS）,细胞能量来源不足而引起的一种异质性疾病。依据受累器官的不同,线粒体病分为线粒体脑病,线粒体肌病和线粒体周围神经病等。线粒体病临床表型复杂多样,症状随发病年龄不同而存在差异,尽管多器官受累是线粒体病的重要特点,但仍有一些线粒体病亚型是以单个器官受累为主要表现。原发性线粒体肌病是指由mtDNA或nDNA突变导致的以骨骼肌受累为主要表现的线粒体病,这里的骨骼肌受累指主要累及骨骼肌但不仅限于骨骼肌,按照目前的认识,原发性线粒体肌病大致分为两大类,以慢性进行性眼外肌麻痹（chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO）或 Kearns-Sayre 综合征为主要表现的眼肌受累表型,以及以躯干肌或肢带肌受累为主要表现的亚型,而后者尚未给予统一命名,有文献称之为单纯线粒体肌病（pure mitochondrial myopathy,PMM）,也有之称为肢带型线粒体肌病（limb girdle mitochondrial myopathy,LGMM）或孤立型线粒体肌病（isolated mitochondrial myopathy,LMM）。我们研究团队认为,用PMM对该临床亚型进行定义更为贴切。PMM在临床中少见,关于PMM的研究,目前国内外均是个案报道,缺少系统的临床、病理及基因研究,认识尚不统一。PMM可能是一种独立的线粒体病亚型,临床表现包括肌无力、运动不耐受、乏力、血清肌酸激酶（creatine kinase,CK）升高、肌痛,较少情况下包括横纹肌溶解。我们研究团队于2003年在国内最先使用这一名词,并对临床中发现的典型案例进行报道。案例分析结果发现,PMM通常为良性病程,但在某些情况下,病情也可迅速进展。我们发现PMM常常被误诊为肌炎、肌营养不良,脂质沉积病等,在临床中对其早期诊断仍具有挑战性。因此,本部分旨在全面分析我们中心近20年的PMM队列临床表现、肌肉病理及基因特征,并进行长时间的随访。我们认为PMM是线粒体病独特的临床亚型,应当被越来越多的临床医生所认识,从而为PMM患者的早期诊断和治疗提供帮助。病例资料和方法1.本项研究纳入对象为:2000年1月至2020年12月间经临床表现、病理结果或基因检测等确诊的36例PMM患者,进行临床资料的收集及长期随访。该研究获得山东大学齐鲁医院伦理委员会的批准。2.对36例PMM患者进行实验室检查及资料收集,包括:初诊及随访CK水平、乳酸水平、颅脑磁共振（MRI）、脑电图、精神状态检查（MMSE）和蒙特利尔认知评估（MoCA）、肌电图,心脏彩超等。3.对36例PMM患者进行骨骼肌活检及组织染色,包括:标准苏木素-伊红（HE）染色、改良Gomori三色（MGT）染色、琥珀酸脱氢酶（SDH）染色、细胞色素c氧化酶（COX）染色、SDH/COX双重染色,油红O（ORO）染色,并对患者肌肉组织进行电镜观察病理改变。4.提取PMM患者多个组织的DNA,包括:外周静脉血、口腔黏膜、尿沉渣及活检骨骼肌组织。选择用肌肉组织DNA进行mtDNA全长和/或nDNA二代测序以寻找致病基因,并用Sanger测序技术进行多组织的验证,总结基因特点。研究结果1.临床和人口资料特征:男性患者/女性患者所占比例为58.3%:41.7%。症状出现的年龄中位数为18.5岁（范围为0-58岁）,确诊PMM的年龄中位数为24.5岁（范围为4-58岁）,症状出现到确诊时的间隔时间为8.0±7.9岁。我们发现,肌无力（n=32,88.9%）是PMM最主要的临床表现,其次是疲劳（n=25,69.4%）,运动不耐受（n=24,66.7%）,肌痛（n=12,33.3%）,肌肉萎缩（n=11,30.6%）,心肌病（n=4,11.1%）和呼吸衰竭（n=8,22.2%）。在所有PMM患者中,有16例患者有线粒体病家族史。2.实验室检查结果:大多数患者（n=31,86.1%）血清CK水平正常或轻中度升高,约半数患者（n=19,52.8%）出现高乳酸血症。31例患者进行了肌电图检查,其中16例患者（51.6%）为肌源性损害,10例患者（32.3%）为神经源性损害,5例患者（16.1%）为正常肌电图表现。所有患者在入组及随访过程中均进行了 MMSE和MoCA评估,所有患者的评分均正常。3.肌肉组织病理特征:所有PMM患者MGT染色上均可见RRF,RRF所占所有肌纤维的比例为2.5%至71.4%之间。31例PMM患者（86.1%）有COX缺失肌纤维,缺失比例为3.0%至93.0%之间。6例患者SDH染色上可见强阳性血管（strongly SDH-positive vessels,SSV）,约有半数患者（n=20,55.6%）ORO染色上可见脂滴轻至中度增多。电镜检查提示线粒体形态和数量的异常。4.基因型特征:21例患者（58.3%）携带mtDNA点突变,其中常见突变m.3243A＞G 突变（11 例）,m.8344A＞G 突变（3 例）,m.8356T＞G 突变（2 例）,m.9176T＞C突变（1例）,以及新发或罕见突变m.5708C＞T突变（2例）,m.7453G＞A突变（1例）,m.14502T＞G突变（1例）,除此之外,我们还发现2例患者携带mtDNA缺失突变。5.随访结果:在36例PMM患者中,共有33例获得随访数据,我们的平均随访时间为6.7±5.8年。33例患者中有25例病情稳定或好转。这些患者大多使用线粒体营养素进行治疗,3例患者在随访过程中死亡,其中2例患者死于呼吸衰竭,1例患者死于心肌病,5例患者在随访过程中有间歇性症状加重。结论1.PMM的临床表现可在相当长时间或始终局限于肌肉,预后多良好。2.PMM常合并亚临床的周围神经病,大部分为轴索型损害。3.PMM的主要遗传缺陷是Mt-tRNA突变。第二部分 单纯线粒体肌病中新发mtDNA变异致病性分析研究背景线粒体是细胞中唯一含有遗传物质的细胞器,其基因全长16569bp,不与组蛋白结合,呈裸露闭环双链状,两条链均有编码功能。mtDNA的整个序列上没有内含子,其编码序列占所有碱基的93%,mtDNA基因排列紧密且缺少组蛋白的保护,在氧化呼吸过程中,极易受到氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的攻击。因此,相对于nDNA来讲,mtDNA更容易出现突变。在mtDNA中,tRNA是热点突变,tRNA易发生突变的原因包括以下三点:第一,相比于细胞质tRNA的典型三叶草结构,线粒体tRNA结构比较松散、不稳定。第二,线粒体tRNA的拷贝数低,一种氨基酸只对应一种线粒体tRNA拷贝。第三,某些线粒体tRNA的二级结构不完整,例如tRNASer（CCU）和tRNALys（UUU）在二级结构上缺少D环,这些都是线粒体tRNA容易出现突变的原因。在PMM的队列中,我们发现3类线粒体新发突变位点,致病性尚未完全明确,包括2例患者携带m.5708C＞T突变,1例患者携带m.7453G＞A突变,1例患者携带m.14502T＞G突变,这三类突变分别位于线粒体tRNAAsn,tRNASer（UCN）以及复合体Ⅰ的ND6亚基。我们对三类新发突变位点的致病性进行了完整的功能验证,并探索了致病机制。本部分主要介绍m.7453G＞A变异位点的致病性验证工作。实验方法本部分将从m.7453G＞A变异对线粒体功能的影响进行致病性验证,具体思路见如下技术路线图。首先,我们用患者及正常对照的肌肉组织进行病理染色,分析患者骨骼肌中的线粒体损害情况,然后在染色标本上选择COX 阳性肌纤维和COX阴性肌纤维进行单纤维DNA测序,用患者及对照肌肉组织进行线粒体蛋白质的合成分析。此外,构建来源于患者以及同一单体型正常对照的转线粒体细胞系,进行单克隆筛选,选择具有相同细胞核背景的野生和突变转线粒体细胞模型,分析细胞的线粒体tRNA稳态水平、线粒体蛋白表达、细胞氧耗速率、ROS产生、线粒体膜电位等线粒体功能指标,从而在多个维度对m.7453G＞A变异的致病性进行验证。#12技术路线图:m.7453G＞A变异的致病性验证方法研究结果1.在PMM队列的基因分析中,我们发现了一例m.7453G＞A在tRNASer（UCN）的新发错义突变,它编码MT-TS1基因。用Sanger测序的方法检测了 m.7453G＞A突变在不同组织中存在异质性,并且该突变在不同物种之间高度保守。肌肉病理的单纤维测序发现,与COX 阳性纤维相比,COX阴性的纤维突变负荷显著升高。2.肌肉组织活检:该患者为典型的线粒体疾病的病理学表现,COX染色发现约有70%的COX阴性肌纤维,其中大多数在MGT染色上表现为破碎样红纤维（RRF）,提示患者的骨骼肌线粒体功能障碍。3.线粒体呼吸链复合体活性:突变细胞呼吸链复合体Ⅰ的活性较野生细胞下降了 59.3%（p＜0.01）,复合体Ⅳ的活性较野生细胞下降了 40.1%（p＜0.05）。4.RNA水平:Northern Blot检测显示携带7453G＞A突变的细胞显示出tRNASer（UCN）总量的下降。以各种线粒体tRNA作为参照,tRNATrp总量分别下降 73.6%、53.8%、53.9%、48.8%、48.6%、50.2%、51.9%、52.3%和 46.1%。5.蛋白水平:Western Blot检测提示患者肌肉样本MT-CYB,MT-CO1和nDNA编码的 NDUFB8和 UQCRC2 显著降低,而 MT-ND1,MT-ND4,和 MT-CO4水平轻度降低,MT-ATP6,SDHB和ATP5A的表达水平不变。突变细胞系中mtDNA 编码的亚基 MT-ND1、MT-ND4、MT-ND5、MT-CYB 和 MT-CO1 的表达降低,降低的程度从22.4%至79.9%,nDNA编码亚基NDFUB8、UQCRC2和mtDNA编码亚基MT-CO4的水平分别为对照组的20.4%、44.3%和72.9%。6.细胞线粒体呼吸评估:我们通过Seahorse能量代谢仪分析了突变细胞和对照细胞的呼吸情况。与野生细胞株相比,突变细胞株在基线水平仅表现出32.8%的基础氧耗速率（oxygenconsumptionrates,OCR）。ATP产生、质子漏、最大呼吸和储备OCR分别降低到31.5%、26.2%、27.2%和9.3%。进一步评估突变对线粒体呼吸链复合体活性的影响,我们发现复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ介导的呼吸率都表现出显著降低,分别为15.8%,21.4%和14.8%。7.细胞ROS产量测定:突变细胞株的红色荧光强度增加到野生细胞株的263%,表明m.7453G＞A突变细胞中ROS的产生增加。8.线粒体膜电位测定:突变细胞株红绿荧光的比值显著降低,为野生细胞株的29.8%,表明m.7453 G＞A突变降低了细胞膜电位。结论1.首次报道并验证了新发m.7453G＞A变异可导致线粒体功能异常从而引起的PMM的临床表型,扩大了 PMM的致病基因谱。2.m.7453G＞A变异影响了 tRNASer（UCN）的表达,导致tRNA的代谢紊乱和线粒体蛋白的翻译异常以及线粒体呼吸链功能缺陷,线粒体ROS生成增多,又进一步破坏线粒体内环境,形成线粒体氧化应激的恶性循环。第三部分 GDF15在单纯线粒体肌病肌肉中的表达及其细胞内的分布特征研究研究背景生长和分化因子15（Growth differentiation factor,GDF15）是转化生长因子β（transforming growth factor beta,TGF-β）超家族的细胞因子。在过去的二十年间,GDF15因其在多种疾病中的多重作用而受到医学领域的广泛关注,包括癌症、心血管疾病和肥胖等。GDF15最初被鉴定为TGF-β超家族的成员,是基于其氨基酸序列与该蛋白质家族其他成员的相似性。GDF15前体蛋白由167个氨基酸组成,在氨基酸位置70处包含一个N连接的糖基化位点。它通过特定的二硫键进行二聚化,形成pro-GDF15二聚体前体,该二聚体蛋白在RXXR位点被切割,形成含有112个氨基酸的成熟GDF15。人类血清中可以找到成熟的GDF15二聚体蛋白,但GDF15前体和前体二聚体是否有活性,目前仍不清楚。在生理状态下,GDF15在胎盘中高度表达,而在结肠、肾脏和前列腺中的表达水平较低,年龄的增高、机体应激状态或者环境因素,都有可能增加GDF15的水平。在病理状态下,多种疾病中GDF15都高表达,包括肿瘤、心血管疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、线粒体病、感染性疾病等。我们的前期研究发现,在线粒体病患者血清中GDF15水平明显增高,并且血清GDF15水平与线粒体病患者临床表现的严重程度呈正相关。我们知道,线粒体病大部分患者都有骨骼肌的损害,那么,GDF15是否会在骨骼肌中表达,以及GDF15在细胞内如何分布,目前尚无研究。因此,本部分通过对PMM队列进行研究,探讨GDF15在骨骼肌中的表达情况,以及明确GDF15在细胞内的分布。研究方法1.对PMM患者进行常规染色及特殊的免疫组织化学染色,常规染色包括:HE染色、MGT染色、SDH染色、COX染色、SDH/COX双染。特殊染色包括:Mitochondria标记线粒体以及GDF15染色。2.为了明确骨骼肌是否可以表达GDF15,我们将患者及健康对照者肌肉组织匀浆并提取蛋白质成分,采用Western blot方法分析线粒体各个复合体蛋白和GDF15蛋白表达情况。3.为了研究GDF15表达与病理损害的相关性,对GDF15蛋白表达量及病理染色上RRF 比例进行相关性分析,同时对病理染色上GDF15阳性肌纤维和RRF进行相关性分析。研究结果1.Western blot结果显示,PMM患者中,线粒体5个亚基水平均有不同程度的降低,其中,2例患者表现为复合体Ⅱ,Ⅲ蛋白水平下降,5例患者表现为复合体Ⅰ,Ⅱ和Ⅳ蛋白水平下降,5例患者表现为复合体Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ蛋白水平下降,4例患者表现为所有复合体蛋白水平均下降。GDF15蛋白的Western Blot检测提示,在健康对照者中,GDF15的表达量很低,而在PMM患者中GDF15蛋白表达水平均有不同程度的升高。2.进一步分析GDF15蛋白水平与病理染色上RRF的相关性,发现两者具有显著的正相关关系（r=0.8114,p＜0.0001）。肌肉样本连续切片进行免疫组织化学分析发现,GDF15阳性肌纤维与RRF具有高度的一致性,相关系数为0.9711,p＜0.0001。结论1.本研究首次观察到PMM患者骨骼肌中的GDF15蛋白水平显著升高,提示GDF15可以在骨骼肌中表达。2.PMM患者的GDF15阳性肌纤维与RRF具有共定位的关系。3.PMM的患者GDF15可能存在线粒体靶向募集或通过线粒体而发挥作用。第四部分 GDF15在线粒体病中的诊断价值研究研究背景线粒体病临床表现存在异质性,即使对于临床经验丰富的医生来讲,线粒体病的诊断仍具有挑战性。目前对于线粒体病的诊断主要基于临床表现、肌肉活检以及基因检测。鉴于肌肉活检的有创性及基因检测的昂贵及耗时等缺点,临床中不能广泛应用于线粒体病的筛查当中。既往也有研究报道,血清中的乳酸、肌酸激酶（CK）和丙酮酸水平可用于线粒体病的筛查诊断,但这些标志物缺乏较好的敏感性及特异性,也不能作为线粒体病首选方法。因此,找到一个可靠的血清生物学标志物对于线粒体病的诊断具有重要意义。GDF15是转化生长因子β超家族成员之一,人体的多种组织器官均可分泌。当机体处于炎症、低氧和氧化应激时,GDF15分泌增加,以维持稳态平衡。近几年,国内外研究发现,GDF15可能为线粒体病潜在的生物学标记物,2014年,GDF15被认为是诊断TK2基因缺陷线粒体病的标志物。2015年,Yatsuga及其同事在一项队列研究中发现,GDF15对于线粒体病的诊断具有高度特异性。2016年,Davis等人表明GDF15比成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor 21,FGF21）具有更高的诊断效能。2019年,Poulsen及其同事进一步研究了GDF15在线粒体病病程及预后方面的作用。本部分,我们对齐鲁医院自2000年以来的线粒体病患者血清中GDF15进行分析,按照不同的临床表型,不同及基因型进行划分,分析GDF15水平组间的差异性。为了进一步明确GDF15在线粒体病中的诊断价值,我们对目前国际上已报道的所有GDF15作为线粒体病诊断标志物的研究进行荟萃分析,以获得更高的循证医学证据。实验方法1.本项研究共纳入2000年1月至2020年12月间经临床表现、实验室检查及肌肉活检诊断的线粒体病患者122例,于清晨空腹状态下进行血液标本采集。2.ELISA分析患者血清GDF15水平,所用试剂盒为Abcam GDF15试剂盒。3.诊断性Meta分析数据收集:遵循诊断性Meta分析相关指南要求,我们对数据库进行了全面检索,检索数据库包括PubMed、EMBASE、MEDLINE、Web of Science和Cochrane,文献截止时间为2020年1月1日之前出版。检索相关关键词为:（“线粒体病”或“线粒体疾病”或“线粒体肌病”或“氧化磷酸化障碍”或“呼吸链缺陷”）和（“Fibroblast growth factor 21”或“FGF-21”或“FGF21”）和（“Growth Differentiation Factor 15”或“GDF-15”或“GDF15”）。4.诊断性Meta数据分析:我们使用系统评价中诊断准确性的质量评估工具2（QUADAS-2）进行数据质量和偏倚风险评估。使用CochranQ和I2分析研究间的异质性。根据可用数据计算每个研究的真阳性值、假阳性值、真阴性值及假阴性值,从而计算诊断比值比,绘制受试者工作特征曲线并计算曲线下面积,进行综合评估。进行敏感性分析及亚组分析寻找异质性来源,绘制Deeks漏斗图评估发表偏倚。实验结果1.ELISA分析提示:（1）线粒体病组中患者血清GDF15水平（2157.1±1974.3pg/ml,范围[109.8-12416.3]pg/ml）明显高于健康对照组（156.4±89.1pg/ml,范围[46.1-423.7]pg/ml）。（2）临床表型分类:以肌病为主的患者血清GDF15水平（2761.9±2148.5pg/ml,范围[165.1-8716.5]pg/ml）明显高于以脑病或者神经病（336.5±301.3pg/ml,范围[135.1-12416.3]pg/ml）为主要表现的患者。（3）基因型分类:携带mt-tRNA突变患者血清GDF15水平（2379.7±2280.4pg/ml,范围[109.8-12416.3]pg/ml）明显高于携带 mt-ND 突变患者（487.3±557.9pg/ml,范围[120.9-2273.7]pg/ml）。2.荟萃分析结果提示:在7项关于GDF15的诊断性研究中,GDF15的敏感性在 0.53 至 0.98 之间（I2 92.93%,95%CI 89.15-96.71）,GDF15 的特异性在0.63 至 0.97 之间（I288.91%,95%CI82.16-95.66）,GDF15 总的敏感性为 0.83（95%CI 0.65-0.92）,总的特异性为 0.92（95%CI 0.84-0.96）。GDF15 的DOR 为 52（95%CI 13-205）,AUC 为 0.94（95%CI 0.92-0.96）,阳性似然比为 9.90（95%CI 4.60-21.20）,阴性似然比为 0.19（95%CI 0.08-0.42）,与FGF21相比,GDF15在线粒体病中的总体诊断效能更好。结论1.线粒体病中,不同临床表型、基因型患者血清GDF15水平存在差异,肌病表型患者血清的GDF15水平明显高于脑病或神经病表型（p＜0.0001）。Mt-tRNA基因型线粒体病患者血清GDF15水平明显高于Mt-ND基因型（p＜0.0001）。2.GDF15、FGF21作为线粒体病的诊断标志物,均有较高的敏感性和特异性。与FGF21相比,GDF15具有更好的诊断效能,应作为筛查线粒体病的重要血清学标志物。