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线粒体虽拥有自身的遗传物质及遗传体系,但超过99%线粒体蛋白仍由核基因编码,这些蛋白在细胞质合成N端含有前导序列的前体蛋白,被线粒体外膜蛋白TOM系统识别并转运,最终转运至线粒体不同区域而发挥作用。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI）是一种Potato I型抑制剂,可以特异性靶向线粒体,与线粒体外膜蛋白Tom 20相互作用,引发线粒体功能障碍,进而引起线粒体自噬而发挥抗肿瘤作用。结构分析,rBTI三维结构中含有一个α-螺旋,具备线粒体蛋白前导序列相似性质。rBTI中这一α-螺旋与Tom 20的相互作用与该螺旋的疏水性质是否相关,以及该螺旋的氨基酸疏水性质的改变对rBTI发挥抗肿瘤活性的影响还未知。因此本文将通过探究rBTI靶向线粒体的识别机制,即α螺旋区与Tom20的相互作用,进一步明确该螺旋的氨基酸组成对rBTI的抗肿瘤效应的影响。主要通过以下内容展开:1.采用原核重组方式表达并纯化了Tom20胞内区。Tom20是一种在线粒体蛋白输入的起始受体膜蛋白,它可以识别具有不同氨基酸序列的前导序列。Tom20包含胞质侧的C端（25-145）、基质侧的N端和膜间隙跨膜三部分,其中胞内区（25-145）是识别前导序列的区域,因此我们对Tom20胞内区进行了重组构建及其原核表达与纯化。通过表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌中表达了Tom20胞内区rTom20,便于进一步研究Tom20与rBTI中α-螺旋的相互作用。2.合成了rBTI螺旋区多肽并做了氨基酸替换,采用紫外分光光度计法、等温滴定量热法体外研究多肽与rTom20的相互作用。人工合成了一系列rBTI螺旋区相似的多肽,将非极性面低疏水丙氨酸A替换为高疏水异亮氨酸I,高疏水I和A替换为低疏水谷氨酰胺Q,将亲水表面的带正电的赖氨酸K替换为疏水不带电的A和亲水带负电的谷氨酸E,增加或降低了多肽的疏水性。采用紫外分光光度计法,等温滴定量热法体外研究rTom20与多肽之间的相互作用,并计算了rTom20与多肽之间相互作用的结合常数模型。结果表明,rBTI螺旋区氨基酸的改变对Tom20的识别结合存在影响。结合常数越大,表明Tom20可以更大程度的识别rBTI螺旋多肽并与之结合,且与rBTI螺旋的疏水性质相关。rBTI螺旋区的疏水性高低与Tom20的结合强弱趋势相同,高疏水性的螺旋与Tom20的结合更强。3.采用定点突变获得相应优化位点的rBTI及其突变体,同时采用MTT法分析了多肽与rBTI及其突变体对Hep G2细胞增殖的抑制作用。我们成功获得了rBTI及其突变体,MTT检测其对细胞增殖抑制作用。多肽的作用结果表明,相比P0,优化后的多肽对Hep G2的细胞活性几乎没有变化;rBTI及其突变体的作用则体现了rBTI螺旋区优化后对Hep G2细胞增殖的影响,rBTI-K20A和rBTI-K23A对Hep G2具有显著的增殖抑制作用,rBTI-K20E、rBTI-K23E、rBTI-K20/23E同样对Hep G2具有明显的增殖抑制作用且这三种突变体的抑制效果相近,但弱于rBTI-K20A和rBTI-K23A的抑制效果。与野生型rBTI相比,非极性面的氨基酸改造rBTI-A21/22I对细胞增殖的抑制有一定加强作用,而rBTI-I24/25A、rBTI-A21/22I-I24/25A、rBTI-A21/22Q-I24/25Q处理组,抑制作用则没有显著变化,与rBTI相似,表现出相似的细胞增殖抑制效果。结合疏水性质和结合常数来看,rBTI螺旋区疏水性增高,与Tom20的结合增强,可以显著抑制Hep G2细胞的增殖。除此之外,rBTI的α螺旋极性面的电荷和疏水性质改变尤为重要。由此,我们初步证明了rBTI中α螺旋可以动态结合至Tom20,通过改变该螺旋非极性面的疏水性,以及极性面的电荷,可以增强或减弱其对Hep G2细胞增殖的抑制作用。上述结果提供了rBTI高效抗肿瘤效应的识别优化,为rBTI开发为一种高效靶向线粒体的天然抗肿瘤药物提供了理论依据。