【摘 要】
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蛋白质和多肽是生物制药领域的支柱,重组蛋白的生产对于新蛋白药物的开发和药物靶标的结构确定都至关重要,其可用于体内的诊断、预防和治疗。而生产重组蛋白的关键是:构建生产目的蛋白的稳定、高产细胞株平台,包括质粒的构建、稳转细胞株的筛选、重组蛋白的特异性检验、细胞株的稳定性分析、细胞株培养条件的优化、重组蛋白的提取纯化,以及重组蛋白的临床应用等研究。本研究旨在构建以CHO细胞为宿主的重组蛋白的生产平台,对
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蛋白质和多肽是生物制药领域的支柱,重组蛋白的生产对于新蛋白药物的开发和药物靶标的结构确定都至关重要,其可用于体内的诊断、预防和治疗。而生产重组蛋白的关键是:构建生产目的蛋白的稳定、高产细胞株平台,包括质粒的构建、稳转细胞株的筛选、重组蛋白的特异性检验、细胞株的稳定性分析、细胞株培养条件的优化、重组蛋白的提取纯化,以及重组蛋白的临床应用等研究。本研究旨在构建以CHO细胞为宿主的重组蛋白的生产平台,对重组蛋白在CHO细胞中的表达及应用进行研究。本研究以CHO-K1作为宿主细胞,以HBsAg、RV-E1为模式蛋白,构建了重组蛋白的真核表达、鉴定、优化、提取纯化平台。首先构建了真核质粒表达载体 pCI-neo-HB sAg,pcDNA3.1（+）-RV-E1。然后用 2.0mg/ml G418 筛选稳转细胞株,共筛得18株高表达HBsAg的稳转细胞株、7株高表达RV-E1稳转细胞株,并对所筛得高表达细胞株进行为期100天的稳定性分析,ELISA、免疫荧光实验结果表明所构细胞株能在100天内稳定、持续表达相应重组抗原,同时ELISA、免疫荧光实验结果表明重组抗原特异性较好。为提高重组抗原产量,对其培养条件进行优化。ELISA实验结果表明:细胞株无血清培养最佳收样时间是72h;当用4mM NaBu刺激细胞时,可使HBsAg滴度提高6.1倍,RV-E1滴度提高2.7倍。同时,用硫酸铵提取纯化重组抗原,将纯化、透析后的重组抗原用临床样本进行检验,免疫荧光实验结果表明重组抗原特异性和活性较好,并初步建立了 HBsAg、RV-E1的免疫荧光检测方法,为血清学诊断奠定了基础。本研究成功构建了基于CHO-K1细胞的的重组蛋白的表达、鉴定、优化、提取纯化平台,且纯化制备的重组抗原HBsAg、RV-E1特异性和活性较好,并初步构建了 HBsAg、RV-E1的免疫荧光检测技术,对HBV病毒和风疹病毒感染的血清学诊断及相应疫苗的开发具有潜在应用价值。
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