微生物发酵菌种一直是燃料乙醇工业发展的瓶颈。利用生物质资源水解产物规模化生产燃料乙醇，选育发酵性能优良的酿酒酵母是关键技术。发酵性能优良的酿酒酵母能够缩短发酵时间，提高发酵醪酒精浓度，提高发酵效率，降低发酵成本，以达到解决当前生物质原料低成本大规模生产燃料乙醇的目的。各国科学家在不同阶段，选用不同技术手段，开展选育发酵性能优良的酿酒酵母的研究。当前，以DNA重组技术改造酿酒酵母，通过代谢途径的扩展以及转移或构建新的代谢途径的研究引起了学者们的极大兴趣。 在酿酒酵母细胞代谢过程中，酿酒酵母产生乙醇的代谢途径与甘油生成代谢途径是相关联的，甘油代谢途径能维持发酵产乙醇过程中的NAD+/NADH平衡。在整个乙醇发酵过程中生成甘油的碳源耗损为整个碳源消耗的4％--10％，使甘油成为酿酒酵母发酵产乙醇过程中主要的副产物之一。从乙醇代谢途径出发，降低甘油代谢提高乙醇产量的研究引起了学者的极大兴趣，构建消耗NADH的代谢流是研究酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的一条有效途径。酿酒酵母基因组中GDH1编码的NADPH依赖型的谷氨酸脱氢酶(Gdhlp)催化2-酮戊二酸生成谷氨酸，同时它还存在存在一个同工酶----GDH2编码的NADH依赖的谷氨酸脱氢酶(Gdh2p)，催化的反应正好和Gdhlp催化的相反。在酿酒酵母中，还存在另一条由GLT1编码的NADH依赖型谷氨酸合酶和GLN J编码的谷氨酰氨合酶催化的谷氨酸代谢途径，它们能催化NADH和ATP生成NAD+和ADP。通过对酿酒酵母GDH1基因的敲除，消除谷氨酸代谢途径对辅酶II (NADPH)依赖，使其专一性的依赖于辅酶I(NADH)进行代谢，从而降低甘油途径的代谢压力，改变酵母细胞中NADH的代谢流，以期减少酿酒酵母发酵过程中的甘油生成，增加碳流向生成乙醇方向的转化，提高酿酒酵母发酵生产乙醇的生成量。 本文以双倍体酿酒酵母SS04出发，采用Cre/LoxP系统基因敲除法对GDH1基因进行基因敲除操作，构建GDH1突变型菌株，进行了生长特性测定和发酵实验，对工业酿酒酵母的基因敲除工程育种技术的应用具有一定的指导意义。文章主要研究了如下几个方面： 1.采用LoxP-Kan-LoxP序列组件和Cre/LoxP系统基因挽救原理敲除酵母的GDH1基因。根据酿酒酵母GDH1的ORF以及其上下游的一段序列设计验证引物A、B、C、D，引物位置分别在ORF的上游序列上、GDH1的ORF上、ORF的下游序列上。根据pUG6的序列设计一个敲除组件引物R1、R2，它们5，端分别是GDH1开放读码框的上游和下游的45bp序列，用来同源重组，3端分别是19bp和22bp的碱基序列，与质粒pUG6中LoxP-Kan-LoxP基因两侧的某段序列互补。以R1、R2为引物，以pUG6质粒为模板，用PCR的方法获得带有LoxP-Kan-LoxP的敲除组件R1-R2。以Kan的ORF为基础，在其上设计引物KB、KC，分别与引物A、D组成引物对A-KB、KC-D，用于验证敲除组件是否正确重组进酵母基因组的GDH1位置。以课题组筛选的酿酒酵母SS04为出发菌株，醋酸锂化学转化法转化敲除组件R1-R2至菌株SS04，同源重组后的菌落能在含G418的YPD平板上生长，挑取这些菌落并提取DNA，PCR验证正确重组了R1-R2的菌落。转化pSH65至上述阳性菌株中，在YPG液体培养基中诱导产生Cre酶，Cre能识别LoxP位点序列并切除LoxP之间的序列和后面一个LoxP序列，在原位置仅留下一个LoxP位点。影印平板法筛选，那些能在YPD平板上生长而不能在含有G418平板上生长的菌落可能就是正确的重组子，PCR验证正确切除了抗性标记的菌株，传代丢失pSH65，得到了一株GDH1的一个等位基因缺失的酵母菌株SS15。从SS15出发，再次按上述步骤敲除另一个GDH1等位基因，并用设计好的验证引物进行PCR验证，获得GDH1基因完全突变的酵母菌株SS17。菌株SS17原GDH1基因位置仅留下一段LoxP位点序列，没有编码异源蛋白的抗性筛选标记基因，适用于工业生产使用菌株的构建，降低了外来基因的生物危害。 2.乙醇发酵实验结果：SS04、SS15、SS17三株菌株的发酵醪中最高乙醇含量依次为9.4％、10.0％和10.2％，其中SS15和SS17菌株的成熟发酵醪中最高乙醇含量与出发株SS04的相比，分别提高了6.4％和8.5％；SS04、SS15和SS17三个菌株的糖转化率分别为86.87％、87.64％和88.74％。这些可能与NADH流向和谷氨酸脱氢酶的表达量有关。 3.在快速提取酵母基因组DNA过程中，实验发现，采用涡旋振荡法提取基因组DNA，在不加玻璃珠而延长涡旋振动时间的条件下，能得到与玻璃珠法提取的DNA同样的效果，并可作为PCR扩增模板使用。和菌落PCR相比，结果理想，无假阴性出现，且降低了实验成本。