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番茄广泛分布于世界各地,是重要的蔬菜作物之一。番茄青枯病是一种由茄科劳尔氏菌所引起的毁灭性土传病害,广泛分布于热带、亚热带以及部分温带地区,每年均造成大量的经济损失,严重制约着番茄产业的发展。由于青枯菌生化变种多,其致病力、生化型和血清型等差异很大,而且寄主范围广,因此青枯菌的防控是一个世界性难题。传统的化学农药防治,不断增强了病原菌的抗药性,而且残留农药污染环境,影响食品安全。生物防治因具有对环境友好、病原菌不容易产生抗性、对人畜安全等优点而备受关注。本文研究了拮抗菌SQRT3对番茄土传青枯病防控效果、在番茄根部的定殖情况和对番茄的诱导抗性等,以初步阐明其防控机理。主要研究结果如下:1.拮抗菌SQRT3在NA培养基上对番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearum ZJ3721有很强的拮抗效果,抑菌圈直径为17-25 mm;而且对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。将菌株SQRT3发酵液通过RP-HPLC进行组分分离收集,通过与青枯菌R.solanacearum对峙试验和质谱分析图推断,分子量为104.3的小分子能够抑制青枯菌生长,该物质未见报道。通过形态学、生理生化和16SrRNA基因的分子生物学鉴定,确定拮抗菌SQRT3为解淀粉芽孢杆菌;拮抗菌SQRT3具有形成生物膜、分泌蛋白酶、植酸酶和铁载体及溶解难溶性无机磷的能力,能够分解蛋白质产生氨;拮抗菌株SQRT3生长的最适温度为30-35℃,pH为7.0,NaCl浓度为1.5%,最佳碳源为蔗糖,氮源为牛肉膏。2.拮抗菌和有机肥配施能够显著提高拮抗菌SQRT3在土壤的存活率,在42天内数量稳定在107 CFU·g-1干土以上,而不添加有机肥的处理在接种初期拮抗菌SQRT3数量下降很快。腐熟的有机肥中添加不同比例的生猪粪对番茄根际土中拮抗菌SQRT3数量、芽孢数量、番茄生物量影响不大。用不同方式接种拮抗菌SQRT3都可以显著减少番茄根际青枯菌的数量,延缓了番茄土传青枯病的发生,降低了发病率;而番茄在含5%淀粉的菌悬液中蘸根处理比在PBS菌悬液中灌根处理防控青枯病的效果更佳,两种处理的生防率分别为81.25%和65.84%。番茄苗在含5%淀粉菌悬液中的蘸根处理在不同时期其拮抗菌数量均超过了PBS菌悬液灌根处理的拮抗菌数量,而其青枯菌的数量明显低于PBS菌悬液灌根处理的。试验表明SQRT3对番茄的生长具有明显的促生作用,植株的鲜重、干重、茎粗、根总长、根体积、根面积以及叶绿素含量都显著高于对照。其中株高和植株地上部分干重分别是CK的1.32倍和1.47倍。HPLC分析结果表明,拮抗菌SQRT3能产生植物生长促生物质包括吲哚-3-乙酸、赤霉素和吲哚丁酸等。3.拮抗菌SQRT3具有植酸酶活性。拮抗菌SQRT3发酵液的植酸酶活性受发酵温度影响较大,37℃为植酸酶活性最适发酵温度,且在第48小时达到最大活性16.33 U mL-1,生长量为OD600=1.96;发酵温度为30℃时,在第72小时达到最大活性11.18 UmL-1,生长量为OD600=3.16;植酸酶能够在较广的pH(pH3.5-8.5)范围内降解植酸,其最适降解条件为37℃和pH 5.5;从拮抗菌SQRT3基因组DNA中扩增出1152 bp的植酸酶(Phytase)基因,编码383个氨基酸,该基因的氨基酸序列与B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum CAU B946的3-phytase基因的氨基酸序列具有100%的同源性。该Phytase蛋白序列第26位和第27位存在信号肽切割位点(26A-K27),成熟蛋白由357个氨基酸残基组成,分子量为39.24 kDa,等电点pI= 4.74。将植酸酶基因克隆到pET28a(+)载体上,转入E.coli BL21中表达,并对其进行纯化,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,可见目的蛋白约为40 kDa。4.通过PEB法成功将GFP标记质粒pHapⅡ转入拮抗菌SQRT3内,得到能够表达GFP的标记菌株SQRT3-GFP;和野生菌相比,标记菌株的生长速度、拮抗能力、成膜能力没有下降或者没有明显下降。纯培养条件下,标记菌株中的质粒pHapⅡ在无选择压力下在短期内保持稳定,培养到第120小时,质粒丢失率为14.2%;在土壤环境中,接种SQRT3-GFP 25天后,其pHapⅡ的丢失率为33.7%。标记菌株悬浮在5%淀粉溶液(处理GS)中后,再通过蘸根方式接种15天后,番茄根表的SQRT3-GFP数量超过了107 CFU·g-1根;而标记菌株悬浮在磷酸缓冲液(PBS)中(处理G),再通过蘸根方式接种,15天后番茄根表的SQRT3-GFP数量低于106 CFU·g-1根,这表明淀粉菌悬液蘸根法使得拮抗菌SQRT3定殖效果更好;SQRT3-GFP主要定殖在番茄的伸长区和成熟区,根尖没有检测到荧光标记的菌株。5.经拮抗菌SQRT3诱导处理的番茄苗在接种R.solanacearum ZJ3721后,叶片中PPO和POD抗性酶的活性快速上升,显著高于未诱导的处理;拮抗菌SQRT3处理能够降低番茄叶片膜脂过氧化程度;拮抗菌SQRT3诱导番茄产生系统抗性主要依靠JA信号途径,pin2基因表达迅速增加,在第24小时相对表达量达到最大值,是RS处理的32.52倍。