第一部分新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞的原代培养目的:本部分研究旨在建立K?lliker器支持细胞体外原代培养体系,探讨其在离体培养培养条件下的生物学特性,生长模式。方法:取出生1到3天的SD大鼠耳蜗,在高倍显微镜下通过机械分离和酶消化相结合的办法分离出纯K?lliker器,进行体外组织培养,并对分离的K?lliker器支持细胞通过免疫组化和RT-PCR扩增的办法进行鉴定。结果:免疫组化染色证明分离的K?lliker器是单一的上皮组织,K?lliker器组织块体外培养后显微镜下发现支持细胞呈现典型的铺路石样外观,细胞间连接紧密,具有明显的增殖能力,在含血清培养基中易形成贴壁细胞;对Hes1,Hes5以及Math1基因进行RT-PCR分析,分离并培养的K?lliker器支持细胞特异性表达Hes1基因。结论:利用酶消化和机械解剖结合的方法可以分离出纯粹的有活性的K?lliker器,K?lliker器支持细胞体外培养具有增殖能力,可得到纯度较高的新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞,并用于进一步的实验研究。第二部分新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞中ATP存在形式的研究目的:本部分研究旨在观察体外培养的新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞中存在ATP囊泡,并证明ATP储存在溶酶体中。方法:分离提纯K?lliker器支持细胞后进行体外原代培养。并通过共聚焦显微镜和透射电镜对支持细胞内标记的囊泡进行了鉴定。染色后的支持细胞加入甘氨酰-L-苯丙氨酸-?-萘酰胺（glycyl-L-phenylalanine-?-naphthylamide,GPN）或碳酰氰4-（三氟甲氧基）苯腙（p-trifluoromethoxyphenylhydrazone,FCCP）和寡霉素后,激光共聚焦显微镜下观察加药前后染色颗粒荧光强度的变化。透射电镜下观察喹丫因染色后K?lliker器支持细胞的超微结构及ATP囊泡。结果:激光共聚焦显微镜下见喹丫因染色后的K?lliker器支持细胞中含大量绿色荧光颗粒,3T3细胞未见该绿色荧光颗粒。在K?lliker器支持细胞中,喹丫因与LAMP1、溶酶体探针共同标记,但不能被线粒体探针标记。Mant-ATP标记的囊泡可以被溶酶体探针染色。GPN加入喹丫因、溶酶体探针处理的K?lliker器支持细胞,荧光强度明显减弱;而用线粒体探针处理K?lliker器支持细胞,荧光强度无明显变化。FCCP和寡霉素加入用喹丫因、溶酶体探针处理的K?lliker器支持细胞,荧光强度无明显减弱;而用线粒体探针处理K?lliker器支持细胞,荧光强度明显减弱。在透射电镜下可以观察到溶酶体被喹丫因标记,而线粒体不能被标记。结论:新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞中存在ATP,共聚焦显微镜和透射电镜观察到的特异性标记细胞器为溶酶体。第三部分新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞ATP释放机制的初步研究目的:本部分研究旨在证实体外培养的新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞能够释放ATP,并探讨K?lliker器支持细胞释放ATP的机制。方法:选取出生后1-3天的SD大鼠,分离并提纯体外培养K?lliker器支持细胞。采用生物发光法,通过影响ATP代谢、改变细胞内外Ca2+浓度、以及抑制细胞内磷脂酶信号通路时等方法,检测K?lliker器支持细胞释放ATP浓度的变化。结果:生物发光法检测ATP的标准曲线呈明显的线性关系。改变细胞内外的Ca2+浓度可以影响ATP释放,此外,抑制细胞内磷脂酶信号通路也会影响ATP的释放。结论:新生大鼠耳蜗K?lliker器支持细胞存在并释放ATP。K?lliker器支持细胞ATP的释放受细胞内外Ca2+浓度变化的影响。此外,抑制磷脂酶信号通路引起的细胞内Ca2+的变化影响了支持细胞ATP的释放。