线粒体是真核细胞中非常重要的细胞器,在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用。线粒体除了参与机体许多生理、病理过程,如ATP的合成、脂肪酸代谢、三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化过程之外,还有其它多种极为重要的生理功能,包括生成活性氧自由基、调节细胞的氧化还原电势和信号转导、调控细胞凋亡和某些基因的表达等。根据人类的基因图谱,估计大约有1000～2 000种线粒体蛋白,迄今大约有600多种被鉴定出来。线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关,如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症等。因此,近几年来,对线粒体蛋白质功能的研究逐渐成为后基因组时代线粒体研究的焦点问题。细胞中的蛋白质是生命活动的主体,它不是孤立地存在的,是在与其它的蛋白质和核酸、小分子等相互作用从而表现其功能。通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征,如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可使其它蛋白质失活,调控其它基因表达。只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。因此,研究蛋白质的相互作用对于了解蛋白质的功能,阐明生命活动的规律有着重要的意义。目前,研究蛋白质相互作用的方法很多,包括酵母双杂交(Yeast two-hybridsystem)、体外结合实验(In vitro binding)、免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation),与质谱联用的亲和层析等,但这些方法花费大,周期长。因此,生物信息学研究蛋白质相互作用的方法提供了一个新的方向,为实验提供了重要的线索。生物信息学研究蛋白质相互作用的过程是在整合人类转录组学,蛋白质组学、代谢组学等各种高通量的数据的基础上,基于蛋白质相互作用动态的网络,结合数据挖掘和信息的整合,利用信息学的理论和动态网络的拓扑学结构对线粒体蛋白质功能进行分析,根据与疾病相关的线粒体蛋白质在网络中的关系,寻找与疾病发生发展相关的新的线粒体蛋白质,探索并阐述与线粒体相关的疾病发生发展的分子机制,为线粒体疾病的研究奠定科学的基础。为疾病基因的发现和致病机理研究的新思路、新途径提供理论基础和实验依据。本课题是在生物信息学分析的基础上,对于预测得到的6对非常可能存在相互作用的人线粒体蛋白质进行实验验证。如果实验证明预测的蛋白对确实存在相互作用,对确定已知线粒体蛋白质的新功能以及对未知功能的线粒体蛋白质进行功能注释提供了新的途径。目前用于蛋白-蛋白相互作用研究的实验方法很多,由于生物体的复杂性和技术手段的有限性,迄今为止,还没有任何一种技术方法能有效地解决问题。因此本课题联合使用了哺乳动物双杂交系统,免疫荧光共定位及免疫共沉淀等进行实验验证,以期使获得的阳性结果更加可靠。哺乳动物双杂交系统是在经典的酵母双杂交系统的基础上发展起来的,但是避免了酵母双杂交技术内在的不足,如许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行,出现假阴性结果。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这就限制了酵母双杂交系统应用在某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。哺乳动物双杂交系统有一个更接近生理环境的蛋白质合成、加工及反应体系,有利于发现起初蛋白质间相互作用。免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。用免疫荧光技术研究未知蛋白的亚细胞定位的基本原理是将不影响抗原(蛋白质)抗体活性的荧光色素标记在抗体上,与其相应的抗原(蛋白质)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。根据荧光的分布并结合亚细胞染色确定未知蛋白在细胞中的位置。由于蛋白的亚细胞定位与其功能有直接的关系,如多数受体分布在细胞膜上,转录因子则转位到细胞核内发挥转录调控作用,因此我们可以通过研究未知蛋白的细胞定位推测其功能。本课题就是将未知(目标)蛋白的编码序列克隆到表达载体上,然后转染细胞。然后用荧光素标记的抗体标记目标蛋白,同时使线粒体显色,根据目标蛋白与线粒体的定位关系判断是否为线粒体蛋白。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。基于上述认识,我们首先构建了含有目标基因的哺乳动物双杂交系统表达质粒pM3-X和pVP16-Y,和荧光素酶报告基因载体共同转染3T3细胞,检测各作用对是否存在相互作用。接下来,我们构建了带有HA标签的pcDNA3-X(Y)-HA表达质粒,转染Hela细胞,48小时后,固定细胞经AlexaFluor488免疫荧光标记,线粒体用MitoFluor Red 589染色后在荧光显微镜下观察蛋白的表达和定位。最后,我们将所有目标蛋白的编码序列以与HA标签融合的形式克隆到pcDNA3-X(Y)-HA载体,为进一步用免疫共沉淀实验验证做准备。通过上述研究,得出以下结论:1.本课题建立了哺乳动物双杂交系统检测蛋白质相互作用的实验平台,得到线粒体蛋白细胞色素P45011A1(CYP11A1)和细胞色素P45011B1(CYP11B1)之间存在相互作用的实验结论,为固醇类激素的代谢的研究提供了新的切入点。2.免疫荧光实验发现BINP3、PEA15、CYP11B1和CYB5R3与线粒体有比较一致的共定位关系,而生理状态下的蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)和线粒体没有共定位。3.成功构建了带有HA标签的pcDNA3-X(Y)-HA的表达质粒,为进一步通过免疫共沉淀检测蛋白的相互作用奠定了基础。本课题的研究结果丰富了线粒体蛋白的信息,并为发现新的线粒体蛋白及线粒体蛋白的相互作用的研究提供了新的思路和方法。