第一部分仿生丝素蛋白支架的构建及结构性能目的:胶原蛋白纳米纤维是骨组织的主要成分之一,为骨组织矿化生长提供必要的三维结构模板,并为骨细胞黏附、增殖及体内成骨提供良好的微环境。因此,理想的骨组织工程支架应具有蛋白质成分与纳米纤维结构特征。为此,本研究以丝素蛋白替代胶原,结合现代加工技术,构建具有仿生结构的丝素蛋白纳米纤维多孔支架。方法:采用盐/甲酸溶解新体系在纳米纤维水平溶解蚕丝,再结合氯化钠致孔剂法制备具有宏观多孔结构与微观纳米结构的仿生丝素蛋白多孔支架。通过扫描电镜、红外光谱、X-射线衍射、力学测试对支架的形态、结构与性能进行表征与分析。结果:盐/甲酸将微米尺寸的蚕丝溶解成丝素蛋白纳米原纤,为构建具有纳米纤维结构特征的丝素蛋白基架提供纳米基元。应用致孔剂法得到的丝蛋白纳米纤维支架的孔径在200-500μm之间,在高倍下可见支架孔壁由更细小的纳米纤维组成。结构测试表明该丝素蛋白多孔支架以β-折叠结构为主。力学测试表明该支架的力学压缩性能良好。支架制备过程中采用了甲醇、乙醇和水三种不同的去盐与处理工艺,处理方法不会影响支架的纳米纤维结构与聚集态结构特征,但会对孔径、孔隙率与压缩性能产生影响。水处理得到的支架具有更大的孔径、更高的孔隙率,更好的力学性能。结论:应用盐/甲酸溶剂蚕丝,并结合致孔剂技术构建了具有宏观三维多孔结构与微观纳米纤维结构共存的仿生丝素蛋白支架。该支架的多孔结构、孔隙率及压缩性能可以通过后处理工艺进行微调。第二部分仿生丝素蛋白多孔支架的生物相容性目的:为了验证仿生丝素蛋白多孔支架的生物相容性,特别是不同溶剂后处理对支架生物相容性的影响,本部分研究通过体外细胞实验,系统研究仿生丝素蛋白多孔支架对细胞黏附、增殖与表型维持的影响,优化支架制备方法。方法:细胞接种于甲醇、乙醇与水工艺后处理仿生丝素蛋白支架上共培养。一定时间培养后,采用激光共聚焦显微镜与扫描电镜观察细胞形态与生长状态;通过CCK-8检测细胞增殖行为;通过RT-PCR检测细胞相关基因表达;通过ELISA检测细胞培养液中的相关蛋白含量。结果:激光共聚焦与扫描电镜结果显示,不同后处理工艺得到的丝素蛋白支架均支持细胞的黏附、铺展与增殖行为。CCK-8结果表明,与有机溶剂甲醇与乙醇相比,水处理得到的支架上细胞增殖更快。RT-PCR与ELISA检测结果同样表面,有机溶剂处理得到的支架对细胞在相关基因与蛋白的表达水平较低。结论:仿生丝素蛋白支架支持OECs的黏附、铺展与增殖,具有良好的生物相容性。与有机溶剂(甲醇、乙醇)处理材料相比,水处理得到的丝素蛋白支架更有利于OECs的增殖,这可能是由于有机溶剂处理后的残留导致一定细胞毒性。溶剂处理组会进一步影响到细胞功能,如OECs功能基因和蛋白的表达。因此,水处理是制备生物相容性良好的仿生丝素蛋白支架的更优工艺。第三部分羟基磷灰石/丝素蛋白复合仿生支架的构建目的:纯丝素蛋白支架缺少必要的骨诱导性和骨传导性,羟基磷灰石不仅是骨组织的主要成分之一,而且已经应用于临床骨缺损再生,显示出优良的骨诱导性、骨传导性和生物相容性。因此,将丝素蛋白与羟基磷灰石结合形成的复合支架,具有与骨组织相似的成分与结构,成为理想的骨组织工程支架。本部分研究在已经构建仿生丝素蛋白纳米纤维支架的基础上,将羟基磷灰石引入构建有机/无机复合支架。方法:不同于以往的直接混合法或矿化法,本实验直接将羟基磷灰石溶解于蚕丝溶解液中,然后再溶解丝素纤维得到混合溶液。然后再应用氯化钠致孔剂与水处理工艺得到羟基磷灰石/丝素蛋白复合仿生支架。通过扫描电镜、能谱、红外光谱、力学测试对支架的形态、结构与性能进行表征与分析。结果:构建了不同比例羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架,复合支架中羟基磷灰石最高含量为40%。扫描电镜结果表明复合支架具有良好的多孔结构,羟基磷灰石分散均匀并与丝素蛋白共同形成网络结构。能谱分析检测到复合支架内钙与磷元素的存在,确定羟基磷灰石存在于复合支架内。红外光谱结果表明复合支架丝素蛋白主要为β-折叠结构,稳定性好。力学性能测试表明羟基磷灰石的加入提高了复合支架的力学性能,且羟基磷灰石含量越高,复合支架力学性能越高。结论:本研究成功构建不同组分比例的羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架,该复合支架具有完整的形态结构、均匀的多孔结构、以及仿生的纳米网络结构,具有典型的silk II结构与优异的力学压缩性能。第四部分羟基磷灰石/丝素蛋白复合仿生支架的成骨特性目的:羟基磷灰石/丝素蛋白复合仿生支架的设计与制备是为了满足骨缺损修复的要求,因此该复合支架的成骨特性是关系到其应用价值与前景的关键。为此,在构建复合仿生支架的基础上,本部分通过体外细胞分化实验与体内骨缺损再生修复实验研究该复合支架的成骨特性,为该复合材料应用于骨缺损修复提供数据支撑。方法:将人脐带血间充质干细胞接种于复合支架上,通过共聚焦显微镜观察细胞形态与生长状态,通过CCK-8定量检测细胞的增殖行为;对接种于复合支架上的干细胞进行成骨诱导分化,通过检测碱性磷酸酶活性,干细胞成骨分化相关基因I型胶原、RUNX2和降钙素基因表达,分析支架对干细胞成骨分化的支持作用与影响。构建大鼠颅骨缺损模型,将优选的羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架与临床用骨粉植入大鼠颅骨缺损模型,采用Micro-CT评估1月和3月后骨缺损修复情况。结果:羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架支持人脐带血间充质干细胞的早期黏附、铺展,并随着培养时间延长不断增殖,10天时已将材料完全覆盖。CCK-8结果表明不同复合比例的支架在细胞增殖方面没有显著性差异。与纯丝素蛋白支架相比,羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架能明显促进干细胞的碱性磷酸酶活性,同时上调成骨分化基因的表达水平。与临床用骨粉相比,羟基磷灰石含量40%的复合支架在促进骨缺损再生方面效果更加明显,这可能与其仿生的纳米结构与组分有关。结论:在本部分实验中,我们证明了羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架与人脐带血间充质干细胞良好的生物相容性,支持细胞的黏附、铺展与增殖,并发现复合支架更有利于干细胞成骨分化,且羟基磷灰石含量越高成骨分化效果越好。动物体内骨修复实验初步证实,羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架与临床用骨粉相比,更能促进骨缺损再生。基于以上研究结果,我们认为本研究制备的羟基磷灰石/丝素蛋白复合仿生支架是一种理想的骨组织工程支架,有望用于临床骨缺损再生。