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研究背景:滋养细胞对胚胎发育和着床、维持正常妊娠中发挥着关键性的作用。其中最为基础且重要的是保障人绒毛外滋养细胞(EVT,Extravilloustrophoblast)的侵袭性无异,使滋养细胞具有正常侵蚀进入蜕膜层的能力,从而参与到子宫内螺旋动脉进行重塑的过程。若EVT侵袭功能失衡,如侵袭减弱则会导致子宫胎盘灌注不足,进而导致妊娠并发症的发生,例如胎儿生长受限(FGR)或子痫前期(Preeclampsia)等;反之若侵袭能力异常增强,则与滋养细胞相关肿瘤类疾病的发生有所关联。除了侵袭能力以外,滋养细胞增殖、分化、凋亡的变化都对正常妊娠以及妊娠并发症存在不可忽视的影响。卵泡抑制素类似物-3(FSTL3,Follistatin-like 3),也被称为卵泡抑制素相关基因(Follistatinrelated-gene),是一种作用于TGF-β超家族的调节性糖蛋白,主要通过在细胞外将自身与TGF-β家族的具有相似结构的不同配体识别并结合的方式,从而使TGF-β家族成员与对应受体之间无法正常识别抑制其作用,是目前公认的多个TGF-β超家族成员的主要拮抗剂之一,例如激活素和生长分化因子8。而TGF-β超家族成员对滋养细胞侵袭功能以及其他功能的调控都起着重要作用,例如激活素A通过调节整合素亚基的表达,激活素A、B及AB通过影响N-钙粘蛋白的产生,从而调节滋养细胞的侵袭性。第一部分 低氧对滋养细胞FSTL3表达的影响目的:检测FSTL3在滋养细胞低氧环境中的蛋白表达水平变化,明确低氧对滋养细胞分泌FSTL3的影响,模拟其在子痫前期发生中的环境,为后续实验提供依据。材料与方法:利用物理法直接降低滋养细胞培养环境氧浓度模拟体外细胞低氧环境,再运用Western Blot在诱导低氧后48h观察滋养细胞内FSTL3蛋白的表达差异。结果:物理诱导法降低培养环境氧含量,经过实验发现SWAN71细胞在5%的氧浓度培养下,其FSTL3表达水平明显高于正常氧浓度20%培养对照组。结论:1.滋养细胞培养环境氧含量下降促进FSTL3表达上调。第二部分 FSTL3表达下调对滋养细胞迁移侵袭功能以及细胞增殖凋亡的作用目的:通过小干扰RNA降低滋养细胞FSTL3表达后,检测滋养细胞迁移能力、侵袭性以及细胞的增殖与凋亡,明确FSTL3的表达是否参与调节滋养细胞的相关功能,探讨其在子痫前期发病机制中的意义。材料与方法:运用siRNA来抑制FSTL3的转录进而减少目标蛋白的产生,并使用Western blot检验FSTL3的蛋白表达量,用以计算siRNA干扰效率。干扰成功后分别通过Transwell小室侵袭法、人为细胞划痕法评估FSTL3对滋养细胞侵袭性和对细胞发生迁移的作用;另外干扰成功后通过CCK-8法和Annexin V荧光标记流式细胞技术分别鉴定滋养细胞的增殖和凋亡变化。结果:1 Western blot鉴定siRNA对滋养细胞内FSTL3表达的干扰效果在对Swan71和JAR细胞进行FSTL3 siRNA干扰48h后检测FSTL3蛋白表达水平,得到结果Swan71和JAR细胞转染后FSTL3表达干扰效率分别为47.95%和47.79%。2 FSTL3表达下降对滋养细胞细胞功能的影响2.1 抑制FSTL3表达对滋养细胞迁移及侵袭性的影响利用人为划痕法观察FSTL3对滋养细胞发生迁移的作用机理,发现FSTL3表达下调显著降低Swan71、JAR的迁移能力;通过观察Transwell实验中侵入到下室的滋养细胞数量来判断滋养细胞的侵袭力的改变,结果表明FSTL3表达下调显著抑制了 Swan71、JAR细胞的侵袭性。2.2 CCK-8与流式细胞法测定滋养细胞增殖和凋亡变化与FSTL3表达的关系经过CCK-8法检测发现siRNA干扰FSTL3表达的实验组滋养细胞增殖明显减少,在空白对照组和阴性对照组之间没有发现统计学差异,提示FSTL3下调引起JAR滋养细胞增殖力降低。利用荧光素FITC为检测手段标记凋亡早期细胞检测标志物Annexin V,利用流式细胞仪检测,结果表明实验组JAR细胞诱导转染FSTL3小干扰RNA后60h,实验组细胞凋亡明显较空白组与阴性对照组增多。结论:1.FSTL3的减少抑制滋养细胞迁移能力、侵袭性2.FSTL3的下调抑制滋养细胞增殖,并且促进滋养细胞凋亡。第三部分 FSTL3在滋养细胞脂肪储积中的作用与影响目的:检测滋养细胞内脂肪储量与FSTL3表达量的相关性。对阐明FSTL3对滋养细胞脂代谢的调节提供了帮助,同时为子痫前期以及其他滋养细胞相关疾病等提供一定的研究基础。方法:运用siRNA干扰目的基因FSTL3的表达后72h,通过油红染色判断降低FSTL-3表达后对滋养细胞脂肪存积的影响。结果:1 油红染色判断FSTL-3表达与滋养细胞脂肪存积的关系进行FSTL3小干扰诱导后72h,对JAR滋养细胞内脂肪进行油红染色鉴定,发现JAR滋养细胞内脂肪储积较阴性对照组显著下降。结论:1.FSTL3表达量的改变可能在调节滋养细胞的脂肪储积中起着重要作用,然而其通过何种具体途径影响脂代谢仍有待更深入的实验设计与探讨。