自1974年提出极端生物（Extremophiles）一词，嗜热菌、嗜冷菌、嗜碱菌、嗜酸菌、嗜盐菌、嗜压菌、嗜金属菌以及耐辐射菌等构成了生命形式的独特风景线。高盐环境中生存的微生物不约而同地吸引了众多研究者。微生物系统学研究表明嗜盐菌和耐盐菌之间没有很明确的分界线。目前已有成千上万株包括古菌、细菌和真菌在内的嗜盐菌/耐盐菌被分离到，为嗜盐分子机制和生命奥秘探索提供了丰富的素材。　　嗜盐机制一直是微生物学家研究的热点。古菌堪称是极端嗜盐菌的代表，大多数类群生存依赖于高浓度的盐，因此最先被研究者们视为嗜盐模型的理想材料。随后嗜盐细菌和真菌嗜盐机理也逐渐被人类所认识，却唯独忽略了嗜盐放线菌嗜盐特性研究。放线菌虽在分类地位上属于细菌，但具有复杂的形态和发育分化，丰富的形态特征，及其多样的次生代谢产物产生能力，是重要的资源微生物。我国学者从盐环境中分离到的放线菌类群和在国际上有效发表的新种、属、科、目连续多年都居全球前列，引领着这个领域的国际潮流，为嗜盐机制研究创造了条件。　　嗜盐机理研究方法主要经历了以下三个阶段:1）20世纪70年代，随着嗜盐菌的生长，基于同位素标记和高分辨核磁共振光谱技术，追踪细胞内外环境中物质成分的变化，研究发现微生物为适应高盐环境，细胞内会积累高浓度的离子和溶质;2）90年代，基于分子生物学技术研究引起细胞内积累离子和溶质的盐相关基因，如细菌中排Na+相关基因、胞内积累K+相关基因及胞内积累小分子相容性物质相关基因等;3）多组学技术也渗入到嗜盐机理研究中，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等。嗜盐机理研究策略也由先前的定性逐渐转向定量、由个别性转向全局性方向发展。　　然而，以往的嗜盐机理分析方法尚存在如下几点不足:1）嗜盐菌材料局限于广为人知的类群，嗜盐放线菌未引起研究者的注意，甚至还没有确立典型菌株。2）盐相关基因研究仅仅是立足于已报道的引起细胞内物质成分变化的基因，而操纵子调控是微生物适应外界环境的高效调控模式，目前并没有全局性地探究引起盐适应性的所有基因簇及符合操纵子调控基因簇的出现。3）全基因组测序泛滥，但真正从基因水平对盐适应性的解读并不多。4）转录组和蛋白质组学定量分析逐渐应用到嗜盐菌领域，虽发现了一些盐相关基因或蛋白，但缺乏进一步的验证和对生物学问题的深层次理解。5）原核生物细胞结构简单，细胞膜是细胞内外环境的屏障，其上嵌入的蛋白（膜蛋白）是最先接受并传递外界信号的，目前还没有系统地研究膜蛋白在盐刺激条件下是如何发挥调控功能的，不同功能膜蛋白间是否存在较大的差异表达，是否还调控着细胞内基础代谢等生物学问题。　　针对以上五点不足，本文对目前研究比较薄弱的嗜盐放线菌盐适应性机理进行了研究。有如下发现:　　1.确立了放线菌嗜盐机理研究的理想材料。目前被描述的嗜盐放线菌有50多个属，其中拟诺卡氏菌（Nocardiopsis）属最多，比例占13％左右，该属中三分之二的物种属于嗜盐/耐盐菌。Nocardiopsis物种盐耐受性比较发现，由我国学者分离自新疆的中度嗜盐放线菌Nocardiopsis xinjiangensis YIM90004T可耐受5-18％浓度的盐，10％浓度生长最佳，盐耐受性范围较广，是严格的中度嗜盐菌。我们在过去基因组草图的基础上进一步完成了该菌株的全基因组测序，总长5.40 Mb，GC含量为69.70％，开放阅读框功能注释程度达77.11％。在此基础上，对该菌株的重复序列(TR和SSR)、CRISPR结构、基因组表观修饰、甲基化修饰以及限制修饰系统进行了分析。盐相关基因分析发现，其他嗜盐菌中已报道的嗜盐/耐盐基因在该菌株中也有分布。此外，筛选并确定了培养N.xinjiangensis YIM90004T菌株的最佳培养基为GYM培养基，进一步发现6％、10％和17.5％分别为该菌株液体培养的最低、最适和最高盐浓度。30℃液体培养至76h、92 h和102h分别为10％、17.5％和6％盐浓度条件下对数生长中期时间点，是后续制备蛋白质组学和转录组学样品的菌体收集时间点。　　2.定量比较了盐诱导性差异表达全蛋白谱。基于iTRAQ化学定量标记策略，比较了6％、10％和17.5％盐浓度条件下全蛋白表达变化。全蛋白经10％ SDS-PAGE检测发现，不同盐浓度条件下菌体提取的蛋白带型呈现显著差异性，尤其是6％样本差异性最明显。经质谱检测，共鉴定到2，749个蛋白，全蛋白覆盖度达63％左右。定量比较共筛选到568个盐诱导性差异蛋白。盐诱导性差异蛋白编码基因定位分析表明差异蛋白中有74个蛋白对应的编码基因在全基因组中形成基因簇，操纵子结构预测发现，这些基因可能组成操纵子结构单元。　　3.论证了膜蛋白在盐适应性过程中发挥了显著的调控功能。通过优化提取策略，本课题成功地提取了嗜盐菌膜蛋白，并获得了比较大的膜蛋白数据集。经iTRAQ标记，共定量到683个膜蛋白，定量比较分析发现126个(18.4％)膜蛋白为差异表达蛋白，且主要富集在调控蛋白家族。面临不同盐浓度刺激时，膜蛋白选择性地启动不同调控系统来调节离子吸收/外排;转运多种渗透调节物质与防御物质调节细胞内外渗透平衡;保持正常的细胞结构与信息传递。中度盐浓度胁迫时，细胞分化、信号传导、小分子溶质转运蛋白，次级代谢相关膜蛋白迅速做出应激，当面临更高盐浓度刺激时，尚需要大分子可溶性溶质ABC家族、Na+-依性性蛋白、细胞运动型和能量相关蛋白等发挥功能。　　4.证明了盐诱导性基因簇符合操纵子结构特征。充分利用RNA-seq转录组测序优势，分析了不同盐浓度条件下所有基因的转录信息。在此基础上比较了上述发现的27个盐诱导性基因簇在转录水平和蛋白质水平的定量变化，结果表明这些基因簇在转录水平和蛋白质水平的表达趋势一致。进一步研究发现这27个基因簇是连续转录的，可能发生共转录形成一条信使RNA，符合操纵子结构特征。在这27个符合操纵子特征的基因簇中包括Pup-蛋白酶体系统。　　5.首次发现高盐刺激条件下类泛素化修饰系统被激活并参与了放线菌盐适应性过程。Pup-蛋白酶体系统是放线菌和氧化亚铁钩端螺旋菌类群中特有的蛋白质降解机制，其他嗜盐菌类群不存在此系统。定量比较发现上述这些基因簇中放线菌类泛素化系统相关基因无论是在转录水平还是蛋白质水平，面临高盐刺激时都呈现高表达，尤其是蛋白酶体结构蛋白和牵拉标记蛋白至蛋白酶体活性中心的蛋白，上调最为显著。高浓度蛋白酶体抑制剂结果表明抑制剂均会影响不同盐浓度条件下菌体的正常生长。稍低浓度抑制剂实验意外地发现，高盐浓度下培养的菌体表现出“逆袭”生长，且中等程度抑制浓度筛选和蛋白酶体活性测定实验结果表明高盐条件下，蛋白酶体呈现高活性。在此基础上，转录组测序结果表明拟诺卡氏耐盐菌N.gilva YIM90087T在不含盐培养时，菌体蛋白酶体结构蛋白呈现低表达，长势也较差。因此一定浓度的盐很有可能会激活蛋白酶体活性从而利于菌体生长。Targeted proteomics和Western blot实验进一步证明了高盐刺激下嗜盐放线菌类泛素化程度增强。　　6.发现膜蛋白和类泛素化修饰系统可能协同参与放线菌盐适应性过程。类泛素化底物蛋白筛选结果发现了30个潜在的底物蛋白，其中有12个蛋白是膜蛋白和膜相关蛋白。前面的膜蛋白质组研究发现ABC家族蛋白是差异膜蛋白中的主要类群，且这些蛋白均是跨膜区负责物质转运的蛋白(Transmembrane domain，TMD)。然而我们在底物筛选中发现其另一类结构蛋白(Nucleotide-binding domain，NBD)，即负责ATP结合和水解的蛋白（Glycine/betaine、Sugar和Peptide）会被Pup标记，发生类泛素化修饰。而且目前已报道的唯一ABC家族类泛素化底物蛋白也是ATP结合结构域蛋白。由此我们推测ABC家族蛋白面临外界高盐环境刺激时，可能会通过类泛素化修饰NBD蛋白增加其活性，从而和TMD结构蛋白协同来应激高盐环境。除此之外，膜蛋白中Na+-依赖性协同转运蛋白也受该系统调控。