论文部分内容阅读
目的:研究妊娠过程小鼠子宫内膜DNA甲基转移酶( DNA methyltransferases,DNMTs)DNMT1,DNMT3a和DNMT3b的表达规律以及它们对胚胎着床的影响,初步探讨DNMTs在胚胎着床中的调控作用。方法:1.建立昆明小鼠妊娠模型,随机收集妊娠第一天(Dl)至妊娠第七天(D7)子宫内膜组织,腊块包埋或于-80℃冻存备用。2.荧光定量PCR检测小鼠妊娠D1-D7子宫内膜DNMTs mRNA的表达,统计分析表达规律;3.免疫组织化学检测妊娠D1-D7的小鼠子宫内膜DNMTs蛋白表达水平,并分析其表达规律;4.随机选择妊娠D1小鼠,于腹腔注射200μl浓度为0 mg/kg,0.1mg/kg和0.5 mg/kg的DNMTs抑制剂5-aza-CdR,建立DNMTs表达抑制的药物诱导小鼠模型,用于检测DNMTs对胚胎着床影响的功能实验。5.荧光定量PCR检测不同浓度5-aza-CdR诱导组妊娠D3、D5小鼠子宫内膜的DNMTs mRNA的表达抑制情况。6.免疫组织化学检测不同浓度5-aza-CdR诱导对妊娠D3、D5小鼠子宫内膜的DNMTs蛋白的表达抑制情况;7.荧光定量PCR和免疫组织化学检测不同药物浓度对妊娠D5小鼠子宫内膜蜕膜化标志基因Hoxa10基因和蛋白表达情况。8.统计分析妊娠D5天,不同浓度药物诱导下胚胎植入数。结果:1. 2-△△T法分析荧光定量PCR结果显示:D1-D7各组小鼠子宫内膜均有DNMTs mRNA表达,其中DNMT1在胚胎着床窗口期前,妊娠小鼠子宫内膜的表达随着孕天增加而增高,至妊娠第3天(D3)达最高峰(P<0.05),随后逐渐降低,胚胎着床后(D6,D7)基本恢复至妊娠D1水平;DNMT3a在妊娠小鼠子宫内膜的表达与DNMT1的表达模式相似,即在胚胎着床窗口期前随着孕天增加而增高,妊娠第3天(D3)达最高峰(P<0.05),随后逐渐降低;DNMT3b与DNMT1和DNMT3a不同,妊娠D3达最高峰(P<0.05),但在着床窗口期后(D5,D6,D7),DNMT3b的表达显著低于妊娠第1天(P<0.01)。2.免疫组织化学结果显示:DNMTs蛋白在妊娠小鼠子宫内膜均有表达。DNMT1主要定位于腔上皮、腺上皮以及基质细胞的胞核,在胞浆弱表达; DNMT3a主要定位于腔上皮、腺上皮以及基质细胞的胞核;DNMT3b主要定位于腔上皮、腺上皮细胞紧密处以及基质细胞的胞浆和部分胞核中。DNMTs的蛋白表达规律基本与mRNA一致,即在妊娠D3表达最高,其后表达逐渐降低。3.0.1 mg/kg 5-aza-CdR诱导妊娠小鼠2天(D3)、4天(D5)后,子宫内膜DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA水平均低于正常组,但差异不显著(P>0.05);0.5mg/kg 5-aza-CdR诱导妊娠小鼠2天(D3)、4天(D5)后,子宫内膜DNMT1、DNMT3a mRNA水平均低于正常组,差异显著(P<0.05);妊娠D3子宫内膜DNMT3b mRNA水平与正常组相比,无显著差异(P>0.05),妊娠D5子宫内膜DNMT3b mRNA水平显著降低(P<0.05);0.5 mg/kg 5-aza-CdR诱导组妊娠D3、D5小鼠子宫内膜DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA水平均显著低于0.1 mg/kg 5-aza-CdR诱导组(P<0.05)。4. 5-aza-CdR诱导后,子宫内膜DNMT1主要定位于腔上皮、腺上皮细胞胞浆以及基质细胞的胞核中;DNMT3a主要定位于腔上皮、腺上皮以及基质细胞的胞核中;DNMT3b主要定位于腔上皮、腺上皮细胞的胞浆中。DNMTs的蛋白表达抑制程度与mRNA的表达抑制具有较高的一致性。5. 0.1 mg/kg 5-aza-CdR诱导组小鼠子宫内膜HOXA10 mRNA、蛋白水平均高于正常组,但差异无显著性(P>0.05);0.5 mg/kg 5-aza-CdR诱导组小鼠子宫内膜HOXA10 mRNA、蛋白水平低于正常组,差异显著(P<0.05)。6.0.1 mg/kg 5-aza-CdR诱导组孕鼠,可见明显胚胎着床点,且着床点数量与药物空白对照组无显著差异(P>0.05);0.5 mg/kg 5-aza-CdR处理孕鼠后,妊娠D5子宫未见任何着床点,药物诱导组与空白对照组之间差异极为显著(P<0.01)。结论:1.DNMTs在妊娠早期子宫内膜组织均有表达;在植入窗口期前高表达,窗口期及着床后表达降低,以及在小鼠子宫内膜的分布变化提示DNMTs可能与胚胎着床相关;2. DNMTs可能通过自身的降低来调节子宫内膜容受性相关的基因表达,从而促进细胞黏附分子、糖蛋白类和细胞因子的表达或分泌,使子宫内膜容受性达最佳状态,以利于胚胎的植入。