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研究背景脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)导致视力丧失的最主要的原因之一,其发病机制至今尚不十分清楚。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞可以通过调节自身多种基因的表达,对缺氧和代谢变化等周围环境的刺激产生快速的应答。在CNV发生的启始阶段,RPE细胞分泌细胞因子和生长因子,促进CNV的生成。随后,增生的脉络膜血管穿破Bruch膜生长至RPE和/或视网膜下,形成CNV。CNV的发生机制十分复杂,受到生长因子和细胞黏附信号等多种因素的影响。参与调控CNV生成的RPE细胞接受多种来源的信号,如可溶性细胞因子信号和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)信号等。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),一种非受体型酪氨酸激酶,在细胞骨架和整合素/细胞因子受体信号的链接中发挥重要的作用,并参与调控细胞增生、存活、移行和分化等细胞进程。ECM和可溶性细胞因子均可活化FAK。进来的研究还表明,FAK参与了新生血管的应答,并且在病理性视网膜新生血管发生中发挥重要的调控作用。然而,FAK在CNV发生中的作用尚未见相关报道。目的和内容探讨FAK在CNV发生中的作用,进一步阐明CNV的发生机制。在建立激光诱导的大鼠CNV模型基础上,观察FAK的表达与CNV生成的相关性;体外观察多种已知与CNV生成相关的危险因素的作用下,培养的人RPE细胞中FAK的表达;运用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制RPE细胞FAK的表达,观察FAK信号通路在CNV发生中的作用。方法⑴激光击穿Bruch膜,建立挪威(Brown Norway,BN)大鼠CNV模型。分别于激光光凝后1、3、7和14天,免疫荧光和Western blot方法观察大鼠CNV中FAK的表达;⑵体外原代培养人RPE细胞,分别暴露于缺氧、H2O2氧化衰老、ECM成分和吞噬光感受器外节膜盘(out segment of photoreceptors,POS)等刺激因素。Western blot方法观察RPE细胞中FAK的表达;⑶运用siRNA技术特异性抑制RPE细胞FAK的表达,RT-PCR、Western blot和ELISA等方法观察缺氧条件下RPE细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达;⑷原代培养牛脉络膜微血管内皮细胞(choroidal endothelial cells,CEC),建立RPE-CEC共培养体系。采用MTT和结晶紫染色等方法观察特异性抑制FAK表达的RPE细胞对CEC增生和移行的影响。结果⑴在激光诱导的BN大鼠CNV生成早期(光凝后1d、3d),RPE-脉络膜复合体中FAK表达显著升高,随后表达逐渐下降。免疫荧光检测显示,FAK的表达上调主要定位于参与CNV生成的RPE细胞中;⑵体外实验表明,目前已知的多种与CNV生成相关的影响因素,如缺氧、氧化衰老、POS代谢产物在胞内堆积以及Bruch膜破裂导致的RPE与ECM成分的接触等,均可不同程度上调RPE细胞内FAK的表达;⑶成功构建了pSilencer/FAK表达载体,通过脂质体介导转染RPE细胞可有效下调FAK的表达。运用siRNA特异性抑制RPE细胞FAK的表达后,可以显著抑制缺氧诱导的RPE细胞HIF-1α和VEGF的表达上调;⑷成功原代培养牛CEC细胞,利用细胞共培养体系观察到RPE细胞与CEC共培养可以刺激CEC的增生和移行,缺氧条件下刺激作用增强。而运用siRNA特异性抑制RPE细胞FAK的表达后,可以显著抑制缺氧条件下RPE细胞对CEC增生和移行的诱导作用。结论本研究首次证实FAK信号参与了激光诱导的大鼠CNV的生成,提示CNV发生早期,活化的RPE细胞内FAK表达的上调参与CNV生成的调控。体外实验表明,多种已知与CNV生成相关的刺激因素均可不同程度上调RPE细胞FAK的表达,进一步提示FAK在CNV发生过程中可能发挥重要调控作用。特异性抑制RPE细胞FAK的表达,可以显著抑制缺氧诱导的RPE细胞HIF-1α和VEGF的表达上调,并进而抑制CEC增生和移行,进一步明确了FAK对CNV生成的调控作用。综上,FAK信号参与了CNV生成过程的调控,此类研究在国内外尚未见报道。针对FAK的siRNA可以抑制CNV生成,这将为临床防治CNV性疾病提供新思路。