第一部分 右美托咪定降低肾移植术后移植物功能延迟恢复:一项随机、双盲、对照的临床研究目的:移植物功能延迟恢复（DGF）是同种异体肾移植术后急性排斥反应和移植物失败的重要危险因素。本研究旨在探讨右美托咪定围术期泵注是否可以降低心脏死亡供体肾移植术后DGF的发生率,是否可以改善术后移植物功能。方法:在这个随机、双盲、安慰剂对照的临床研究中,选取2019年09月至2021年01月共114例诊断为终末期肾脏疾病拟在全麻下行肾脏移植手术的患者。纳入标准:年龄大于18周岁,捐赠者为心脏死亡供体。排除标准:病窦综合征或房室传导阻滞,心脏左室射血分数＜30%,接受多器官移植的患者。将患者按1:1比例随机分为右美托咪定组（麻醉诱导后立即静脉泵注右美托咪定0.4μg/kg/h至手术结束,拔除气管导管后继续泵注右美托咪定0.1 μg/kg/h,维持24h）和生理盐水对照组。两组采用吸入1%-3%七氟烷维持全身麻醉,麻醉深度维持脑电双频指数（BIS）值40-60,根据手术需要和患者的反应追加舒芬太尼和顺式阿曲库胺。手术结束时,给与以舒芬太尼为基础的患者自控静脉镇痛,在手术结束时开始泵注,维持到术后48小时。手术结束后拔除气管导管,然后患者转移至指定的移植病房。主要研究结果为移植术后DGF发生率,DGF定义为移植术后第一周至少需要一次血液透析或者腹膜透析治疗。次要研究指标包括术后一周内重复透析例数,住院期间急性排斥反应例数,术后30天指标（血清肌酐,血清胱抑素C,肾小球滤过率[eGFR],需要透析例数,患者的生存率）。围术期其他指标包括:住院期间移植物功能指标（血清肌酐,血清胱抑素C,肌酐清除率,尿量）,术后视觉模拟量表疼痛（VAS）评分,术后心动过缓和低血压的发生率。事后（posthoc）分析的结果包括:移植后第二天的肌酐下降率（CCR2）,CCR2＜30%的比例,长期随访结果（血清肌酐、血清胱抑素C、eGFR、同种异体肾移植失败、患者生存率）,所有患者长期随访至2021年7月31日。结果:最终共111例患者完成了研究（右美托咪定组,n=56;对照组,n=55）。右美托咪定组中有10名患者发生DGF,发生率为17.9%,生理盐水组中有19名发生了 DGF,发生率为34.5%,两组相比差异有统计学意义（odds ratio[OR],0.41;95%confidence interval[Cl],0.17-0.98;P=0.045）。右美托咪定组术后第一周发生重复透析的患者为7例,发生率为12.5%,生理盐水组术后第一周发生重复透析的患者为17例,发生率为30.9%,右美托咪定组重复透析的患者低于生理盐水组（12.5%vs.30.9%;OR,0.32,95%Cl,0.13-0.88;P=0.019）,但在多重检验校正后无显著性差异。住院期间急性排斥反应右美托咪定组和生理盐水组相比无统计学差异（8.9%vs.12.7%;OR,0.67,95%Cl,0.22-2.14;P=0.519）。和生理盐水组相比,右美托咪定组移植30天后血清肌酐,血清胱抑素C,eGFR无统计学差异（P＞0.05）。在移植30天后,右美托咪定组有1例患者,生理盐水组有3例患者仍需要透析治疗,移植30天后无患者死亡。两组患者住院期间的血清肌酐和血清胱抑素C差异无统计学意义（P＞0.05）。右美托咪定组术后第一天（9.9[4.9,21.2]vs.7.9[2.0,10.4]mL/min;difference=2.0 mL/min;95%CI,0.5-6.8 mL/min）和术后第二天（29.6[9.7,67.4]vs.14.6[3.8,45.1]mL/min;difference=15.0mL/min;95%CI,0.4-18.5 mL/min）的肌酐清除率高于生理盐水组,差异有统计学意义（P＜0.05）。右美托咪定组术后第二天（106.5[66.3,175.6]vs.82.9[27.1,141.9]mL/h;difference=23.6 mL/h;95%CI,0.2-59 mL/h）,术后第七天（126.1[98.0,151.3]vs.107.0[82.5,137.5]mL/h;difference=19.1 mL/h;95%CI=1.7-36.3 mL/h）和出院当天（110.4[92.8,121.9]vs.97.1[77.5,113.8]mL/h;difference=13.3 mL/h;95%CI,4.2-22.5 mL/h）的尿量高于生理盐水组,差异有统计学意义（P＜0.05）。右美托咪定组术后30分钟、术后24小时的VAS评分明显低于生理盐水组,差异有统计学意义（P＜0.05）。右美托咪定组术后发生心动过缓的共有9例患者,发生率为16.1%,生理盐水组发生心动过缓的共有5例患者,发生率为9.1%,两组之间无统计学差异（P＞0.05）。右美托咪定组术后发生低血压的共有8例患者,发生率为14.3%,生理盐水组发生低血压的共有6例患者,发生率为10.9%,两组之间无统计学差异（P＞0.05）。事后分析中,右美托咪定组CCR2为36.5%（IQR,1.4%-53.5%）,CCR2＜30%所占比例为 46.4%,生理盐水组 CCR2 为 23.6%（IQR,-0.1%-51.2%）,CCR2＜30%所占比例为56.4%,两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。术后随访的中位时间为13（四分位数间距[IQR],9-19）个月。远期随访结果显示,和生理盐水组相比,右美托咪定组血清肌酐、血清胱抑素C均无统计学差异（P＞0.05）。远期随访右美托咪定组eGFR平均值为71.1 ± 20.2 mL/min,生理盐水组eGFR平均值为62.7±24.6 mL/min,两组患者eGFR差异无统计学意义（P=0.051）。右美托咪定组远期随访时均不需要透析治疗,而生理盐水组有3例患者（5.5%）仍需要透析治疗,两组患者生存率均为100%。结论:围术期输注右美托咪定能降低心脏死亡供体肾移植手术患者术后移植物功能延迟恢复,改善早期移植物功能。第二部分右美托咪定通过激活α2/PI3K/Akt/eNOS信号通路和抑制炎症反应减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）通过调控α2/PI3K/Akt/eNOS信号通路和抑制炎症反应来发挥小鼠肾脏缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤肾脏的保护作用及机制。方法:（1）右美托咪定预处理加后处理对小鼠肾脏I/R损伤肾脏功能的影响。将18只健康成年小鼠随机分为3组（每组n=6）:假手术组、I/R组、DEX+I/R组。干预组中的小鼠行开腹夹闭双侧肾蒂,45分钟后松开双侧动脉夹恢复双侧肾脏血流灌注,建立在体肾脏缺血再灌注损伤模型。而假手术组的小鼠肾脏只分离肾蒂而不夹闭肾蒂。DEX+I/R干预组小鼠在麻醉时给与右美托咪定（50 μg/kg）预处理,小鼠麻醉30分钟后,夹闭双侧肾蒂造成肾脏I/R损伤,缺血45分钟后再次给与右美托咪定（50μg/kg）缺血后处理,并松开双侧动脉夹恢复双侧肾脏血流灌注。所有组的动物均在再灌注48小时取双侧肾脏组织和全血标本,观察肾脏组织学和功能学改变。（2）全转录组mRNA测序,分析肾脏I/R损伤后差异基因（DEGs）的生物学过程、信号通路和蛋白相互作用。将6只健康成年小鼠随机分为2组（每组n=3）:假手术组、I/R组。再灌注48小时取双侧肾脏组织标本,全转录组mRNA测序,分析I/R组和假手术组之间DEGs的生物学过程、信号通路和蛋白相互作用。（3）定量聚合酶链反应（qPCR）验证损伤相关信号通路上的差异基因。将12只健康成年小鼠随机分为2组（每组n=6）:假手术组、I/R组。我们通过qPCR方法进一步验证了损伤相关信号通路上的相关差异基因变化。（4）右美托咪定预处理加后处理在肾脏I/R损伤模型中对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（phosphatidylinositol 3 kinases/protein serine threonine kinase,PI3K/Akt）信号通路、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、一氧化氮（NO）表达的影响。将12只健康成年小鼠随机分为3组（每组n=4）:假手术组、I/R组、DEX+I/R组。再灌注48小时后使用Western Blotting方法检测3组肾脏组织中PI3K、磷酸化的p-PI3K、Akt、磷酸化的p-Akt、eNOS的蛋白表达水平,并使用NO试剂盒检测3组小鼠肾脏组织中NO的含量。（5）右美托咪定预处理加后处理在肾脏I/R损伤模型中对炎症细胞因子的影响。将18只健康成年小鼠随机分为3组（每组n=6）:假手术组、I/R组、DEX+I/R组。再灌注48小时后取小鼠肾脏组织和血清,分别使用qPCR和酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）的方法检测3组小鼠肾脏组织和血清中炎症细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-6、细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion mo l ecule-1,ICAM-1）、单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）表达含量。（6）使用α2受体阻滞剂阿替美唑（Atip）干预来研究右美托咪定通过α2受体发挥肾脏保护作用。将20只健康成年小鼠随机分为4组（每组n=5）:假手术组、I/R组、DEX+I/R、Atip+DEX+I/R组。Atip+DEX+I/R组小鼠麻醉时同时给与右美托咪定（50μg/kg）和阿替美唑（250μg/kg）,小鼠麻醉30分钟后,夹闭双侧肾蒂构建肾脏I/R损伤模型,缺血45分钟后再次给与右美托咪定（50 μg/kg）和阿替美唑（250μg/kg）,并松开双侧动脉夹恢复双侧肾脏血流灌注。所有组均再灌注48小时取双侧肾脏组织,观察肾脏组织学变化并进行组织学损伤评分。（7）右美托咪定通过α2受体对I/R肾脏中的PI3K/Akt通路、eNOS和NO发挥作用。将16只健康成年小鼠随机分为4组（每组n=4）:假手术组、I/R组、DEX+I/R组、Atip+DEX+I/R组。再灌注48小时取双侧肾脏组织,使用Western Blotting方法检测4组肾脏组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达水平以及eNOS的蛋白表达水平,并使用NO试剂盒检测4组小鼠肾脏组织中NO的含量。（8）右美托咪定通过α2受体发挥对I/R肾脏炎症细胞因子的影响作用。将20只健康成年小鼠随机分为4组（每组n=5）:假手术组、I/R组、DEX+I/R组、Atip+DEX+I/R组。再灌注48小时取双侧肾脏组织,使用qPCR的方法检测4组肾脏组织中炎症细胞因子的变化。（9）通过使用α2受体阻滞剂和PI3K激动剂（740Y-P）共同干预来研究右美托咪定对I/R肾脏PI3K/Akt通路、eNOS和NO的影响。将20只健康成年小鼠随机分为 5 组（每组 n=4）:假手术组、I/R 组、DEX+I/R 组、Atip+DEX+I/R、Atip+740Y-P+DEX+I/R组。小鼠麻醉时同时给与右美托咪定（50μg/kg）、阿替美唑（250μg/kg）和740Y-P（2.5 mg/kg）,小鼠麻醉30分钟后,夹闭双侧肾蒂构建肾脏I/R损伤模型,缺血45分钟再次给与右美托咪定（50μg/kg）、阿替美唑（250 μg/kg）和740Y-P（2.5 mg/kg）,并松开双侧动脉夹恢复双侧肾脏血流灌注。再灌注48小时取双侧肾脏组织,使用Western Blotting方法检测5组肾脏组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达水平以及eNOS的蛋白表达水平,并使用NO试剂盒检测5组小鼠肾脏组织中NO的含量。（10）通过使用α2受体阻滞剂和PI3K激动剂共同干预来研究右美托咪定对I/R肾脏炎症细胞因子的影响。将20只健康成年小鼠随机分为5组（每组n=4）:假手术组、I/R 组、DEX+I/R 组、Atip+DEX+I/R 组、Atip+740Y-P+DEX+I/R 组。再灌注 48小时取双侧肾脏组织,使用qPCR的方法检测5组肾脏组织中炎症细胞因子的变化。（11）通过使用α2受体阻滞剂和PI3K激动剂共同干预来研究右美托咪定对I/R肾脏组织学的影响。将25只健康成年小鼠随机分为5组（每组n=5）:假手术组、I/R 组、DEX+I/R 组、Atip+DEX+I/R 组、Atip+740Y-P+DEX+I/R 组。再灌注 48 小时取双侧肾脏组织,观察5组肾脏组织学变化并进行组织学损伤评分。结果:（1）和假手术组相比,I/R组肾脏的组织学损伤评分明显增加,血肌酐和尿素氮水平显著升高（P＜0.01）,而右美托咪定预处理加后处理可以明显降低肾脏缺血再灌注后肾脏组织学评分,血肌酐和尿素氮水平也明显下降（和I/R组相比,P＜0.01）。（2）全转录组mRNA测序共确定了 2486个具有统计学差异的DEGs,其中包括1901个上调基因,585个下调基因。GO富集分析由DEGs参与的前三个生物学过程分别为:应激反应、单和多细胞生物过程、细胞成分组织。KEGG富集分析提示与组织损伤相关信号通路前三位为PI3K/Akt信号通路、TNF-α信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路。（3）q-PCR验证了肾脏缺血再灌注损伤组PI3K、Akt、eNOS、TNF-α和核转录因子（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）在 mRNA 水平显著高于假手术组（P＜0.01）,而p53、FOXO4、Bax/Bcl2在mRNA水平两组无显著差异。（4）Western blotting测定显示肾脏缺血再灌注损伤中p-PI3K、p-Akt较假手术组升高,右美托咪定预处理加后处理可以使p-PI3K、p-Akt的表达水平更进一步升高。总PI3K、总Akt水平在肾缺血再灌注后和右美托咪定处理后均没有明显改变。I/R组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS、NO 水平较假手术组升高（P＜0.01）,DEX+I/R 组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS、NO 水平明显高于 I/R 组（P＜0.01）。（5）qPCR和ELISA均显示肾脏I/R损伤可以在mRNA水平和蛋白水平明显升高炎症细胞因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1的表达含量（P＜0.01）,右美托咪定预处理加后处理可以明显降低肾脏I/R损伤后炎症细胞因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1 的表达（P＜0.05）。（6）和DEX+I/R组相比,α2受体阻滞剂干预明显增加了肾脏I/R后的组织学损伤评分（P＜0.01）。（7）和 DEX+I/R 组相比,Atip+DEX+I/R 组肾脏的 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS和NO的表达水平明显降低（P＜0.01）。（8）和DEX+I/R组相比,Atip+DEX+I/R组肾脏的炎症细胞因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1的表达水平明显升高（P＜0.01）。（9）和 Atip+DEX+I/R 组相比,Atip+740Y-P+DEX+I/R 组肾脏的 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS和NO的表达水平明显升高（P＜0.01）。（10）和Atip+DEX+I/R组相比,Atip+740Y-P+DEX+I/R组肾脏的炎症细胞因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1 的表达含量明显降低（P＜0.01）。（11）和Atip+DEX+I/R组相比,Atip+740Y-P+DEX+I/R组肾脏组织学评分明显降低（P＜0.01）。结论:右美托咪定预处理加上后处理可以减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤,可能是通过激活α2/PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制炎症反应来发挥肾脏保护作用。