【摘 要】
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目的:微小RNA miR-23b-3p、促性腺激素释放激素受体（gonadotropin-releasing hormone receptor,GnRHR）和双特异性磷酸酶 1（dual specificity phosphatase-1,DUSP1）均参与肿瘤细胞增殖、转移等多种生物学过程,但它们在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancers,TNBC）中的表达模式
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目的:微小RNA miR-23b-3p、促性腺激素释放激素受体（gonadotropin-releasing hormone receptor,GnRHR）和双特异性磷酸酶 1（dual specificity phosphatase-1,DUSP1）均参与肿瘤细胞增殖、转移等多种生物学过程,但它们在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancers,TNBC）中的表达模式、生物学作用和分子调控机制尚不清楚。本文主要研究miR-23b-3p、GnRHR和DUSP1对TNBC增殖、转移的生物学作用及其分子机制。方法:（1）采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 miR-23b-3p 在三种乳腺癌细胞 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和正常乳腺细胞MCF-10A中的表达。构建miR-23b-3p的模拟物（miRNA mimics）和抑制物（miRNA inhibitor）,分别转染体外培养的TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468,采用CCK-8和克隆形成实验检测细胞生长增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和周期、划痕法和Transwell检测细胞迁移侵袭。（2）体外培养MDA-MB-231细胞,分别转染GnRHR质粒使GnRHR过表达、转染GnRHR siRNA以敲低GnRHR,采用CCK-8、划痕法和Transwell检测GnRHR对细胞增殖、转移的影响,并观察GnRHR能否逆转miR-23b-3p对细胞增殖、转移的作用。（3）构建miR-23b-3p稳定低表达的MDA-MB-231细胞株,并以此构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察敲低miR-23b-3p对肿瘤增殖的影响,以及肿瘤组织GnRHR表达变化。从TCGA公共数据库获取miR-23b-3p和GnRHR表达数据,分析两者在乳腺癌组织中的表达关系,以及与预后的关系。收集本中心手术的TNBC标本,采用免疫组化检测GnRHR蛋白表达。（4）采用双荧光素酶报告基因分析检测miR-23b-3p和GnRHR基因的相互作用,采用蛋白质印迹法（western blot,WB）检测miR-23b-3p对GnRHR的影响。体外培养MDA-MB-231细胞,转染GnRHR质粒使GnRHR过表达,以RNAseq 检测 mRNA 表达谱的变化,以 WB 检测 p-AKT/AKT、p-ERK/ERK、MMP2的变化。结果:（1）MDA-MB-468细胞和MDA-MB-231细胞中miR-23b-3p的表达水平较高,而MCF-10A细胞和MCF-7细胞中miR-23b-3p的表达水平较低。在体外培养的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中转染miR-23b-3pmimics后,细胞生长、增殖、迁移、侵袭能力均提高,而转染miR-23b-3pinhibitor产生相反作用。（2）在体外培养的MDA-MB-231细胞中转染GnRHR过表达质粒或siRNA,结果GnRHR抑制TNBC增殖、转移,并逆转miR-23b-3p促进TNBC增殖、转移的生物学作用。（3）分别采用miR-23b-3p低表达和野生型MDA-MB-231细胞构建裸鼠皮下种植瘤模型,结果miR-23b-3p低表达的肿瘤生长较慢,GnRHR蛋白表达水平更高。TNBC患者癌组织中miR-23b-3p和GnRHR表达呈负相关,miR-23b-3p在TNBC中高表达,与患者无病生存期（Disease-Free Survival,DFS）差有关,而GnRHR在TNBC中低表达,亦与TNBC患者DFS差有关。（4）双荧光素酶报告基因检测发现miR-23b-3p能够直接结合并下调GnRHR,WB检测提示miR-23b-3p抑制GnRHR蛋白表达。RNAseq检测发现GnRHR过表达后DUSP1的表达上调,WB检测提示GnRHR过表达后p-AKT/AKT、p-ERK/ERK、MMP2下降。结论:miR-23b-3p在TNBC中高表达,具有促进TNBC增殖、转移的作用,并与患者预后不良有关,其分子机制可能为miR-23b-3p抑制GnRHR表达,进而抑制DUSP1表达,使ERK、AKT不能被去磷酸化失活、MMP2表达上调,最终促进TNBC增殖和转移。miR-23b-3p/GnRHR/DUSP1轴可能是TNBC的一个新的潜在治疗靶点。
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