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第一部分妊娠期糖尿病妊娠结局的调查研究目的:通过分析妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)孕妇年龄、孕产次、孕前体重指数(Body Mass Index,BMI)、分娩方式、新生儿体重、胎盘重量和新生儿体重/胎盘重量(fetal/placental weight,F/P)比率等因素,探讨与GDM发病的相关性因素,在孕期实现对GDM的合理干预,改善母婴妊娠结局。方法:1.采用回顾性研究,选择定期产检并住院分娩且病例资料完整的孕产妇总人数354名,其中177名GDM孕妇作为病例组,另选177例正常孕妇作为对照组。对孕妇基本情况包括年龄、孕产次、孕前BMI、分娩方式、新生儿体重、胎盘重量和F/P进行收集整理;2.GDM组与对照组间各因素进行单因素分析和多因素Logistic回归分析。结果:1.GDM组孕妇年龄高于对照组(p<0.01);2.GDM组孕、产次多于对照组(分别为p<0.01和p<0.05),孕、产次差异有统计学意义;两组分娩方式无统计学意义(p>0.05);3.GDM组孕前BMI、胎盘重量高于对照组(p<0.01和p<0.05),F/P低于对照组(p<0.01),有显著统计学意义;而孕期体重增长和新生儿体重,两组差异无统计学意义(p>0.05);4.年龄和孕前BMI是影响GDM的高危因素。结论:1.GDM发病高危因素中,年龄是独立危险因素;2.孕前BMI会独立影响胎盘重量,降低胎盘效率,影响胎盘功能;3.多孕产次可能是2型糖尿病的风险因素,加强健康教育和产前护理;4.GDM胎盘重量明显增加,F/P 比率显著降低,GDM影响胎盘运输效率,导致胎盘供血不足。第二部分HIF-1α对妊娠期糖尿病胎盘VEGF和Bcl-2表达的影响目的:探讨缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和 b 细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)在妊娠期糖尿病胎盘的表达,分析HIF-1α通过调控下游靶基因,上调VEGF和Bcl-2,下调天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3),HIF-1α参与妊娠期糖尿病的发病机制。方法:1.随机纳入两组研究对象,正常妊娠且无产科合并症及并发症的20例为对照组,妊娠期糖尿病20例为实验组,分析两组胎盘中HIF-1α、VEGFA、Bcl-2、Bcl-2基因家族及其相关蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)和Caspase-3的表达;2.采用组织免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术检测HIF-1α、VEGFA和Bcl-2在两组胎盘组织中的定位表达;3.采用实时定量 PCR(Realtime-quantitative PCR,RT-PCR)检测 HIF-1α、VEGFA、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA分别在两组胎盘组织的表达水平;4.采用蛋白免疫印迹(western blot,WB)方法检测HIF-1α、VEGFA、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-3-cleaved蛋白在两组胎盘组织的表达情况。结果:1.两组孕妇年龄、孕次、产次、建卡时BMI和分娩时孕周均无统计学差异(p>0.05);2.HIF-1α主要在胎盘合体滋养细胞的细胞核表达,其在GDM胎盘的表达明显增加,VEGFA和Bcl-2主要在胎盘合体滋养细胞的细胞质表达,GDM胎盘VEGFA和Bcl-2表达明显增加;3.GDM 组 HIF-1α、VEGFA 和 Bcl-2 mRNA 水平表达明显增加(p<0.05),Caspase-3 mRNA水平表达显著减少,差异具有统计学意义(p<0.01),Bax mRNA水平两组间无明显统计学差异(p>0.05);4.GDM 组 HIF-1α、VEGFA、Bcl-2 蛋白水平表达明显增加,Caspase-3-cleaved在蛋白水平表达显著减少,差异具有统计学意义(p<0.0 1),Bax和Caspase-3两组表达无明显差异(p>0.05)。结论:1.HIF-1α、VEGFA、Bcl-2和Caspase-3在GDM胎盘的异常表达可能与GDM的发病有关;2.HIF-1α在GDM胎盘的异常表达表明,HIF-1α可能增加VEGFA和Bcl-2表达,减少Caspase-3-cleaved合成,促进胎盘滋养细胞增殖,减少滋养细胞凋亡,HIF-1α在乏氧条件下控制细胞生长和凋亡中发挥作用,可能参与GDM发病机制。第三部分乏氧激活HIF-1α诱导VEGF和Bcl-2的表达对滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响目的:乏氧激活HIF-1α诱导VEGF和Bcl-2基因表达,通过影响滋养细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡,参与GDM的发病。本研究旨在探讨HIF-1α、VEGF和Bcl-2在GDM发病机制中的相互作用。方法:1.采用氯化钴(Cobaltous dichloride,CoCl2)构建 HTR-8/SVneo 和 JAR 细胞株乏氧模型;2.HTR-8/SVneo 和 JAR 细胞株经 CoCl2 处理,采用 RT-PCR 和 western blot 方法分析 HIF-1α、VEGFA、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 的表达;3.建立HIF-1α siRNA沉默HTR-8/SVneo和JAR细胞系,经CoCl2处理后采用RT-PCR 和 western blot 方法分析 HIF-1α、VEGFA、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 的表达;4.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、EdU和Transwell迁移侵袭实验检测乏氧或/和HIF-1α siRNA沉默对HTR-8/SVneo和JAR细胞增殖、迁移和侵袭的影响;5.采用Annexin V-FITC/PI双染流式法检测乏氧或/和HIF-1α siRNA沉默对HTR-8/SVneo和JAR细胞凋亡的影响;6.免疫荧光检测乏氧或/和HIF-1α siRNA沉默对HTR-8/SVneo和JAR细胞的HIF-1α和VEGF在细胞中表达的影响。结果:1.在乏氧的条件下,HIF-1α表达与CoCl2浓度呈正相关;2.RT-PCR结果显示,经CoCl2处理后,HIF-1α、VEGFA和Bcl-2表达上调和Caspase-3表达下调,差异具有统计学意义(p<0.01),Bax mRNA水平两组间无明显统计学差异(p>0.05);3.Western blot结果显示,经CoCl2处理后,HIF-1α、VEGFA和Bcl-2表达上调和Caspase-3-cleaved表达下调,差异具有统计学意义(p<0.01),Bax和Caspase-3水平两组间无明显统计学差异(p>0.05);4.沉默HIF-1α细胞模型中,HIF-1α、VEGFA和Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,Caspase-3-cleaved蛋白表达明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.01);Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平无显著差异;5.沉默HIF-1α抑制了 HTR-8/SVneo和JAR细胞增殖、迁移和侵袭,差异具有统计学意义(p<0.01);6.沉默HIF-1α促进了 HTR-8/SVneo和JAR细胞凋亡,差异具有统计学意义(p<0.01);7.HIF-1α在HTR-8/SVneo和JAR细胞的细胞核中表达,VEGFA在细胞质中表达,在乏氧的条件下HIF-1α和VEGFA表达均增强,沉默HIF-1α时VEGFA表达下调。结论:1.CoCl2模拟乏氧诱导HIF-1α蛋白的积累,并改变乏氧相关基因VEGFA和Bcl-2的表达;2.沉默HIF-1α改变乏氧相关基因VEGFA和Bcl-2的表达,参与滋养细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。